Vyhláška Ministerstva zdravotnictví č. 48/2001 Sb.
Vyhláška Ministerstva zdravotnictví, kterou se mění vyhláška Ministerstva zdravotnictví č. 1/1998 Sb., kterou se stanoví požadavky na jakost, postup při přípravě, zkoušení, uchovávání a dávkování léčiv (Český lékopis 1997), ve znění vyhlášky č. 296/1999 Sb.
Platný
Vyhláška
Účinnost od 15.02.2001
Verze znění:
15.02.2001
Zobrazeno prvních 200 z celkem 21086 ustanovení tohoto předpisu.
Zobrazit celý předpis →
Pro stažení celého znění použijte tlačítko Stáhnout výše.
48
VYHLÁŠKA
Ministerstva zdravotnictví
ze dne 4. ledna 2001,
kterou se mění vyhláška Ministerstva zdravotnictví č. 1/1998 Sb., kterou se stanoví požadavky na jakost, postup při přípravě, zkoušení, uchovávání a dávkování léčiv (Český lékopis 1997), ve znění vyhlášky č. 296/1999 Sb.
Ministerstvo zdravotnictví po projednání s Ministerstvem zemědělství a Ministerstvem průmyslu a obchodu stanoví podle § 75 odst. 4 zákona č. 79/1997 Sb., o léčivech a o změnách a doplnění některých souvisejících zákonů, ve znění zákona č. 149/2000 Sb.:
1. V příloze části 2 Zkušební metody, kapitola 2.2 Fyzikální a fyzikálně-chemické metody, kapitoly 2.2.24 a 2.2.25 znějí:
„
2.2.24 Absorpční spektrofotometrie v infračervené oblasti 
Spektrofotometry v infračervené oblasti se používají pro záznam spekter v oblasti od 4000 cm-1 do 670 cm-1 (2,5 μm až 15 μm) nebo v některých případech až do 200 cm-1 (50 μm). Spektrofotometry s Fourierovou transformací využívají polychromatické záření a Fourierovou transformací se převádí spektrum z původních dat do frekvenční reprezentace. Mohou být také použity spektrofotometry opatřené optickým systémem schopným vytvářet monochromatické záření v měřené oblasti. Normálně je spektrum dáno jako funkce transmitance, poměrem intenzity propuštěného a dopadajícího záření.
Absorbance A je definována jako dekadický logaritmus převrácené hodnoty transmitance T a je vyjádřena vztahem:
v němž značí:
T - I/I0,
I0 - intenzitu dopadajícího monochromatického záření,
I - intenzitu prošlého monochromatického záření.
Příprava vzorku
Pro záznam s využitím propustnosti nebo absorpce. Látka se upraví jedním z následujících postupů.
Kapaliny. Kapalina se zkouší buď jako film mezi dvěma destičkami propustnými pro infračervené záření, nebo v kyvetě vhodné tloušťky rovněž propustné pro infračervené záření.
Kapaliny nebo pevné látky v roztoku. Připraví se roztok ve vhodném rozpouštědle. Zvolí se koncentrace a tloušťka kyvety tak, aby se získalo vhodné spektrum. Dobré výsledky se zpravidla získají s koncentracemi od 10 g/l do 100 g/l pro tloušťku kyvety 0,5 mm až 0,1 mm. Absorpce způsobená rozpouštědlem by měla být kompenzována vložením podobné kyvety s použitým rozpouštědlem do referenčního paprsku.
Pevné látky. Pevné látky se zkoušejí dispergované ve vhodné kapalině (suspenze) nebo v pevné látce (halogenidová tableta) podle toho, co je vhodnější. Je-li to v článku předepsáno, připraví se film z taveniny mezi dvěma destičkami propustnými pro infračervené záření.
(a) Suspenze. Rozetře se malé množství zkoušené látky s minimálním množstvím tekutého parafinu R nebo jiné vhodné kapaliny; k přípravě vhodné suspenze stačí zpravidla 5 mg až 10 mg zkoušené látky. Suspenze se stlačí mezi dvě destičky propustné pro infračervené záření.
(b) Tableta. Není-li uvedeno jinak, rozetřou se 1 mg až 2 mg zkoušené látky s 300 mg až 400 mg jemně práškovaného a vysušeného bromidu draselného R nebo chloridu draselného R. Tato množství postačují zpravidla k přípravě tablety o průměru 13 mm a k získání spektra vhodné intenzity. Směs se pečlivě rozetře, stejnoměrně se jí naplní vhodná forma a slisuje se ve vakuu tlakem asi 800 MPa (8 t.cm-2). Z různých příčin mohou vzniknout špatné tablety: např. nedostatečné nebo přílišné roztírání, vlhkost nebo jiné nečistoty v dispergujícím prostředí a nedostatečné rozmělnění částeček. Tableta se nepoužije, vykazuje-li při vizuální kontrole nejednotnou propustnost, nebo je-li transmitance při asi 2000 cm-1 (5 μm) v nepřítomnosti specifického absorpčního pásu menší než 75 % bez kompenzace.
Plyny. Plyny se zkoušejí v kyvetě propustné pro infračervené záření mající optickou dráhu asi 100 mm. Kyveta se evakuuje a naplní se na požadovaný tlak pomocí kohoutu nebo jehlového ventilu při použití vhodné trubice pro převod plynu mezi kyvetou a nádobou obsahující zkoušenou látku. Je-li to nutné, upraví se tlak v kyvetě na tlak atmosférický použitím plynu propustného pro infračervené záření (např. dusíku R nebo argonu R). K odstranění interference absorpce způsobené vodou, oxidem uhličitým nebo jinými atmosférickými plyny se vloží do referenčního paprsku stejná kyveta, která je buď evakuována, nebo naplněna plynem propustným pro infračervené záření.
Pro záznam s využitím mnohonásobné reflexe
Je-li tento záznam předepsán v článku, upraví se látka jednou z následujících metod.
Roztoky. Látka se rozpustí ve vhodném rozpouštědle za podmínek uvedených v článku. Roztok se odpaří na thalliumbromido-jodidové destičce nebo na jiné vhodné destičce.
Pevné látky. Látka se homogenně rozprostře na thalliumbromido-jodidové nebo jiné vhodné destičce.
Identifikace s použitím referenčních látek
Stejným způsobem se upraví jak zkoušená, tak i referenční látka a za stejných podmínek se zaznamenají spektra od 4000 cm-1 do 670 cm-1 (2,5 μm až 15 μm). Minima propustnosti (absorpční maxima) spektra zkoušené látky odpovídají polohou i relativní intenzitou hodnotám referenční látky (CRL).
Vykazují-li spektra zaznamenaná v pevném stavu rozdíly v polohách minim propustnosti (absorpčních maxim), zpracuje se stejným způsobem zkoušená i referenční látka tak, aby vykrystalizovaly nebo vznikly ve stejné formě, nebo se postupuje tak, jak je předepsáno v článku, a pak se zaznamenají spektra.
Identifikace s použitím referenčních spekter
Kontrola rozlišovací schopnosti. Zaznamená se spektrum 0,04 mm silného polystyrenového filmu. Rozdíl x (viz obr. 2.2.24-1) mezi procenty transmitance při maximu propustnosti A při 2870 cm-1 (3,48 μm) a minimu propustnosti B při 2849,5 cm-1 (3,51 μm) by měl být větší než 18. Rozdíly mezi procenty transmitance při maximu propustnosti C při 1589 cm-1 (6,29 μm) a minimu propustnosti D při 1583 cm-1 (6,32 μm) by měl být větší než 12.
Ověření stupnice vlnočtů. Stupnice vlnočtů může být ověřena použitím polystyrenového filmu, který má minima propustnosti (absorpční maxima) při vlnočtech v cm-1 uvedených v tab. 2.2.24-1.
Tab. 2.2.24-1 Minima propustnosti (a přijatelná tolerance) polystyrenového filmu v cm-1.
| 3060,0 (±1,5) |
| 2849,5 (±1,5) |
| 1942,9 (±1,5) |
| 1601,2 (±1,0) |
| 1583,0 (±1,0) |
| 1154,5 (±1,0) |
| 1028,3 (±1,0) |
Pracovní postup. Zkoušená látka se připraví podle návodu uvedeného u referenčního spektra. Za pracovních podmínek, které byly použity při kontrole rozlišovací schopnosti, se zaznamená spektrum zkoušené látky a na něj se superponují absorpční pásy polystyrenu při 2849,5 cm-1 (3,51 μm), 1601,2 cm-1 (6,25 μm) a 1028,3 cm-1 (9,72 μm). Porovnají se obě spektra a maxima polystyrenu uvedená výše. Použijí-li se polohy maxim polystyrenu jako referenční hodnoty, pak polohy význačných maxim spektra zkoušené látky musí odpovídat význačným maximům referenčního spektra s odchylkou nejvýše 0,5 % vlnočtové stupnice. Relativní intenzity maxim obou spekter by měly být shodné.
Nečistoty v plynech
Pro analýzu nečistot v plynech se použije kyveta propustná pro infračervené záření s vhodnou optickou dráhou (např. 1 m až 20 m). Naplní se způsobem uvedeným v odstavci Plyny. Detekce a kvantifikace nečistot se provede podle postupu uvedeného v článku.
Obr. 2.2.24-1 Typické spektrum polystyrenu používané při kontrole rozlišovací schopnosti
2.2.25 Absorpční spektrofotometrie v ultrafialové a viditelné oblasti
Absorbance A je definována jako dekadický logaritmus převrácené hodnoty transmitance T pro monochromatické záření a je vyjádřena vztahem:
v němž značí:
T - I/I0,
I0 - intenzitu dopadajícího monochromatického záření,
I - intenzitu prošlého monochromatického záření.
V homogenním prostředí je měřená absorbance (A) úměrná tloušťce vrstvy (b), kterou záření prochází a koncentraci absorbující látky v roztoku (c) podle vztahu:
v němž značí:
ε - molární absorpční koeficient (absorptivita), je-li koncentrace (c) vyjádřena v mol/l a tloušťka vrstvy (b) v cm.
Výraz je specifická absorbance, která vyjadřuje absorbanci roztoku látky o koncentraci 10 g/l měřenou v 1cm vrstvě při určité vlnové délce:
Není-li uvedeno jinak, měří se absorbance při předepsané vlnové délce v 1cm vrstvě při (20 ± 1) °C a měření se provádí proti použitému rozpouštědlu nebo směsi rozpouštědel. Absorbance použitého rozpouštědla měřená proti vzduchu při předepsané vlnové délce by neměla být vyšší než 0,4, a je přednostně menší než 0,2. Absorpční spektrum se vynese jako závislost absorbance nebo její funkce (osa pořadnic) na vlnové délce nebo její funkci (osa úseček).
Jestliže v článcích je uváděna jedna hodnota vlnové délky pro maximum absorpce, může se nalezená hodnota od této lišit nejvýše o ± 2 nm.
Zařízení. Spektrofotometry vhodné pro měření v ultrafialové a viditelné oblasti spektra se skládají z optického systému schopného poskytovat monochromatické záření v rozsahu 200 nm až 800 nm a ze zařízení vhodného pro měření absorbance.
Kontrola vlnových délek. Správnost stupnice vlnových délek se ověřuje pomocí hodnot absorpčních maxim roztoku chloristanu holmitého R, poloh čar pro vodíkovou, resp. deuteriovou lampu nebo poloh čar pro rtuťové páry, které jsou uvedeny v tabulce 2.2.25-1. Povolená tolerance je ± 1 nm pro ultrafialovou oblast a ± 3 nm pro viditelnou oblast.
Tab. 2.2.25-1 Absorpční maxima pro kontrolu stupnice vlnových délek.
| 241,15 nm (Ho) | 404,66 nm (Hg) |
| 253,7 nm (Hg) | 435,83 nm (Hg) |
| 287,15 nm (Ho) | 486,0 nm (Dβ) |
| 302,25 nm (Hg) | 486,1 nm (Hβ) |
| 313,16 nm (Hg) | 536,3 nm (Ho) |
| 334,15 nm (Hg) | 546,07 nm (Hg) |
| 361,5 nm (Ho) | 576,96 nm (Hg) |
| 365,48 nm (Hg) | 579,07 nm (Hg) |
Kontrola absorbance. Správnost stupnice absorbance se ověřuje roztokem dichromanu draselného R při vlnových délkách uvedených v tabulce 2.2.25-2, v níž jsou pro každou vlnovou délku udány přesné hodnoty specifické absorbance a povolené limity. Tolerance pro absorbanci je ±0,01. Pro kontrolu absorbance se použije roztoku dichromanu draselného R připraveného takto: rozpustí se 57,0 mg až 63,0 mg dichromanu draselného R předem vysušeného při 130 °C do konstantní hmotnosti v kyselině sírové 0,005 mol/l RS a zředí se jí na 1000,0 ml.
Tab. 2.2.25-2
| Vlnová délka (nm) | Specifická absorbance | Maxima tolerance |
|---|---|---|
| 235 | 124,5 | 122,9 až 126,2 |
| 257 | 144,5 | 142,8 až 146,2 |
| 313 | 48,6 | 47,0 až 50,3 |
| 350 | 107,3 | 105,6 až 109,0 |
Limit rozptýleného světla může být sledován při daných vlnových délkách pomocí vhodných roztoků nebo filtrů. Např. absorbance roztoku chloridu draselného R (12 g/l) měřená v 1cm vrstvě při 200 nm musí být vyšší než 2 v porovnání s vodou R jako kontrolní kapalinou.
Rozlišovací schopnost (pro kvalitativní analýzu). Pokud je to předepsáno v článku, je třeba provést měření rozlišovací schopnosti přístroje takto: zaznamená se spektrum roztoku toluenu R 0,0 2% (V/V) v hexanu R. Minimální poměr absorbance v maximu při 269 nm k absorbanci v minimu při 266 nm je uveden v článku.
Spektrální šířka štěrbiny (pro kvantitativní analýzu). Aby se předešlo chybám při měření způsobeným spektrální šířkou štěrbiny při použití přístroje, kde šířka štěrbiny při zvolené vlnové délce může být měněna, musí být šířka štěrbiny malá ve srovnání s polovinou šířky absorpčního pásu, ale současně musí být co největší, aby byla získána vysoká hodnota I0. V každém případě šířka štěrbiny přístroje by měla být vždy taková, aby při jejím dalším zmenšení nedocházelo ke změnám v odečtu absorbance.
Kyvety. Povolená tolerance vnitřní vzdálenosti protilehlých stěn používaných kyvet je ± 0,005 cm. Naplní-li se týmž rozpouštědlem, musí kyvety pro zkoušený roztok a pro kontrolní kapalinu mít stejnou transmitanci. V opačném případě je třeba zavést příslušnou korekci.
Kyvety je nutno čistit a zacházet s nimi opatrně.
Derivační spektrofotometrie
Derivační spektrofotometrie znamená transformaci absorpčního spektra (nultého řádu) v 1., 2. nebo vyšší derivaci spektra.
První derivace spektra (derivační spektrum 1. řádu) je závislost gradientu absorpční křivky (změna absorbance s vlnovou délkou, dA/dλ) na vlnové délce.
Druhá derivace spektra (derivační spektrum 2. řádu) je závislost zakřivení absorpčního spektra na vlnové délce (d2A/dλ2). Druhá derivace při jakékoliv vlnové délce λ je úměrná koncentraci podle následujících rovnic:
v nichž značí:
c' - koncentraci absorbující látky v g/l.
Zařízení. Použije se spektrofotometr vybavený analogovým odporově-kapacitním diferenčním modulem nebo digitálním diferenciátorem, nebo případně jiným zařízením vytvářejícím derivační spektra. U některých metod tvorby druhé derivace spektra vzniká vlnový posun vzhledem ke spektru nultého řádu, a to je nutno v těchto případech uvažovat.
obr. 2.2.25-1
Obr. 2.2.25-1
Rozlišovací schopnost. Pokud je předepsáno v článku, zaznamená se derivační spektrum druhého řádu roztoku toluenu R (0,2 g/l) v methanolu R za použití methanolu R jako kontrolní kapaliny. Ve spektru je malý záporný extrém umístěný mezi dvěma velkými zápornými extrémy při 261 nm a 268 nm, viz obrázek 2.2.25-1. Není-li uvedeno jinak, poměr A/B (viz obrázek 2.2.25-1) není menší než 0,2.
Pracovní postup. Připraví se roztok zkoušené látky, nastaví se vhodné instrumentální podmínky podle návodu výrobce a množství stanovované látky se vypočítá způsobem uvedeným v článku.
“
2. V příloze části 2 Zkušební metody, kapitola 2.2 Fyzikální a fyzikálně-chemické metody, kapitola 2.2.31 zní:
„
2.2.31. Elektroforéza
OBECNÝ PRINCIP
Působením elektrického pole nabité částice rozpuštěné nebo dispergované v roztoku elektrolytu migrují ve směru elektrody opačné polarity. Při gelové elektroforéze je pohyb částic zpomalován interakcemi s okolní gelovou matricí, která působí jako molekulární síto. Protichůdné působení elektrické síly a molekulárního prosívání vede k různým migračním rychlostem podle velikosti, tvaru a náboje částic. Vzhledem k jejich odlišným fyzikálně-chemickým vlastnostem migrují různé makromolekuly směsi během elektroforézy různými rychlostmi, a tak se rozdělují do jednotlivých frakcí. Elektroforetické separace se mohou provádět v systémech bez podpůrných fází (např. separace ve volném roztoku při kapilární elektroforéze) a ve stabilizujících médiích, jako jsou tenkovrstvé desky, filmy nebo gely.
VOLNÁ ELEKTROFORÉZA NEBOLI ELEKTROFORÉZA S POHYBLIVÝM ROZHRANÍM
Tato metoda se používá hlavně ke stanovení elektroforetické pohyblivosti, přičemž experimentální charakteristiky jsou přímo měřitelné a reprodukovatelné. Využívá se hlavně pro látky s vysokými relativními molekulovými hmotnostmi a s nízkými difuzními koeficienty. Poloha rozhraní se na počátku stanoví fyzikálními metodami, jako je refraktometrie nebo konduktometrie. Po aplikaci elektrického pole se po přesně změřeném čase pozorují nová rozhraní a jejich vzájemná poloha. Je nutno volit takové pracovní podmínky, aby bylo možné určit tolik rozhraní, kolik je složek.
ZÓNOVÁ ELEKTROFORÉZA V NOSIČI
Pro tuto metodu postačuje pouze malé množství vzorku.
Povaha nosiče, jako je papír, agarový gel, acetat celulosy, škrob, agarosa, methylakrylamid, směsný gel, zavádí řadu dalších faktorů ovlivňujících elektroforetickou pohyblivost:
a) následkem porozity nosiče je naměřená migrační vzdálenost menší než skutečná migrační dráha,
b) některé nosiče nejsou elektroneutrální a mohou někdy vyvolat významný elektroendoosmotický tok,
c) jakékoliv zahřívání v důsledku Jouleova efektu může způsobit odpařování kapaliny z nosiče, což v důsledku kapilarity způsobí pohyb roztoku od krajů do středu. Iontová síla má z tohoto důvodu tendenci postupně vzrůstat.
Rychlost migrace potom závisí na čtyřech hlavních faktorech, zejména na pohyblivosti nabité částice, elektroendoosmotickém toku, toku způsobeném odpařováním a intenzitě elektrického pole. Proto je nezbytné pracovat za zcela přesně definovaných experimentálních podmínek a používat, kdekoliv je to možné, referenčních látek.
Zařízení pro elektroforézu se skládá ze:
- zdroje stejnosměrného elektrického proudu, jehož napětí může být regulováno a stabilizováno,
- elektroforetické komory, obvykle pravoúhlé, vyrobené ze skla nebo pevného plastu se dvěma oddělenými prostory, anodickým a katodickým, obsahujícími roztok elektrolytu. V každém prostoru je ponořena elektroda, např. platinová nebo grafitová. Elektrody jsou propojeny vhodně izolovaným obvodem se zdrojem stejnosměrného proudu, jehož kladný pól se připojí k anodě a záporný pól ke katodě. Hladina kapaliny v obou prostorech se udržuje na stejné úrovni, aby se předešlo toku způsobenému sifonovým efektem.
Elektroforetická komora je uzavřena vzduchotěsným víkem, které udržuje během operace vlhkostí nasycenou atmosféru a snižuje odpařování rozpouštědla. Z bezpečnostních důvodů se používá zařízení k přerušení elektrického proudu při sejmutí víka. Překročí-li elektrický výkon 10 W, doporučuje se chlazení nosiče.
- zařízení na upevnění nosiče:
Proužková elektroforéza. Proužek nosiče, předem navlhčený používaným roztokem elektrolytu a ponořený na obou koncích do elektrodových prostorů je vhodně napnutý a upevněný k podložce nosiče, který zabrání difúzi elektrolytu. Podložkou může být vodorovný rámeček, podstavec ve tvaru obráceného V nebo deska s vyčnívajícími hroty umístěnými ve vhodných vzdálenostech.
Gelová elektroforéza. Zařízení se skládá ze skleněné desky (např. mikroskopické sklíčko), na jejíž celou plochu je nanesena pevně přilnavá vrstva gelu stejné tloušťky. Elektrické spojení mezi gelem a vodivým roztokem je zajištěno různými způsoby podle druhu použitého zařízení. Je třeba učinit předběžné opatření, aby se zabránilo kondenzaci vlhkosti nebo vysychání pevné vrstvy.
- měřícího nebo detekčního zařízení.
Pracovní postup. Roztok elektrolytu se nalije do elektrodových prostorů. Nosič nasycený elektrolytem se umístí do komory způsobem vhodným pro dané zařízení. Vyznačí se místo startu a nanese se vzorek. Na předepsanou dobu se zapojí elektrický proud. Po vypnutí zdroje se nosič vyjme z komory, vysuší se a separované látky se vizualizují.
ELEKTROFORÉZA V POLYAKRYLAMIDOVÉM GELU V TRUBIČKÁCH
Při tomto typu elektroforézy je stacionární fází gel, který je připraven ze směsi akrylamidu a N,N'-methylen-bisakrylamidu. Gely jsou připraveny do trubiček délky 7,5 cm a o vnitřním průměru 0,5 cm. Na každou trubičku se nanáší jeden roztok.
Zařízení. Skládá se ze dvou nad sebou umístěných nádobek na tlumivý roztok vyrobených z vhodného materiálu, jako je polymethylmetakrylat. Každá nádobka je vybavena platinovou elektrodou. Elektrody jsou připojeny ke zdroji umožňujícímu práci buď při konstantním proudu, nebo při konstantním napětí. Zařízení má na dně horní nádobky několik držáků stejně vzdálených od elektrody.
Postup stanovení. Před polymerací gelu by měly být roztoky odplyněny a gely použity bezprostředně po přípravě. Připraví se směs gelu podle předpisu a nalije se do vhodných skleněných trubiček s uzavřeným dnem do stejné výšky asi 1 cm od horního okraje. Je nutné zajistit, aby v trubičce nezůstaly bublinky vzduchu. Směs gelu se převrství vodou R, aby se zamezilo přístupu vzduchu a nechá se zpolymerovat. Tvorba gelu trvá obvykle asi 30 min a je ukončena, když se objeví ostré rozhraní mezi gelem a vrstvou vody. Vrstva vody se odstraní. Spodní nádobka se naplní předepsaným tlumivým roztokem a odstraní se uzávěry trubiček. Trubičky se upevní do držáků v horní nádobce tak, aby spodní část trubiček byla ponořena v tlumivém roztoku spodní nádobky. Trubičky se opatrně naplní předepsaným tlumivým roztokem. Připraví se zkoušený roztok a kontrolní roztok, oba obsahující vhodné značkovací barvivo, zahustí se např. tím, že se v nich rozpustí sacharosa R. Tyto roztoky se nanášejí na povrch gelu jednotlivých trubiček, přičemž pro každý roztok se použije jiná trubička. Do horní nádobky se nalije stejný tlumivý roztok. Elektrody se připojí ke zdroji elektrické energie a elekroforéza se nechá probíhat za předepsané teploty a při předepsaném konstantním napětí nebo předepsané intenzitě proudu. Zdroj energie se vypne v okamžiku, kdy značkovací barvivo doputuje téměř ke spodní nádobce. Trubičky se ze zařízení okamžitě vyjmou a gel se z nich uvolní. Poloha jednotlivých zón v elektroforeogramu se deteguje předepsaným způsobem.
SDS ELEKTROFORÉZA V POLYAKRYLAMIDOVÉM GELU
Rozsah použitelnosti. Gelová elektroforéza v polyakrylamidu se používá ke kvalitativní charakterizaci bílkovin v biologických přípravcích, ke kontrole čistoty a ke kvantitativnímu stanovení.
Účel. Analytická gelová elektroforéza je vhodná metoda, kterou se prokazuje totožnost a homogenita bílkovin ve farmaceutických přípravcích. Tato metoda se rutinně používá ke stanovení molekulových hmotností bílkovin a bílkovinných podjednotek a ke stanovení složení podjednotek purifikovaných bílkovin.
Náhradou za gely a zkoumadla popsaná v tomto textuje možno použít komerčně běžně dostupné gely a zkoumadla, za předpokladu, že poskytují odpovídající výsledky a že vyhovují validačním požadavkům uvedeným v odstavci Validace zkoušky.
CHARAKTERISTIKY POLYAKRYLAMIDOVÝCH GELŮ
Sítovací vlastnosti polyakrylamidových gelů jsou založeny na trojrozměrné síti vláken a pórů, kterou tvoří bifunkční bisakrylamidové zesíťování polyakrylamidových řetězců. Polymerace je katalyzována tvorbou volných radikálů z peroxodisíranu diamonného a tetramethylethylendiaminu.
Zvyšováním koncentrace akrylamidu v gelu se snižuje účinná velikost jeho pórů. Účinná velikost pórů gelu je pracovně definovaná jeho prosívacími vlastnostmi, tj. odporem, který klade pohybu makromolekul. Jsou dány limity koncentrací akrylamidu, které mohou být používány. Při vysokých koncentracích akrylamidu se gel láme mnohem snáze a je s ním obtížnější manipulace. Se snižující se velikostí pórů gelu se snižuje i migrační rychlost průchodu bílkovin gelem. Úpravou velikosti pórů gelu pomocí změny koncentrace akrylamidu může být rozlišovací schopnost metody optimalizována pro daný bílkovinný produkt. Proto je daný gel fyzikálně charakterizován pomocí odpovídajícího složení akrylamidu a bisakrylamidu.
Stav bílkoviny je vedle složení gelu důležitým faktorem elektroforetické pohyblivosti. U bílkovin závisí elektroforetická pohyblivost na hodnotě pK nabitých skupin a velikosti molekuly. Je ovlivňována typem, koncentrací a hodnotou pH tlumivého roztoku, teplotou a silou pole a také vlastnostmi materiálu nosiče.
ELEKTROFORÉZA ZA DENATURAČNÍCH PODMÍNEK V POLYAKRYLAMIDOVÉM GELU
Metoda citovaná jako příklad je omezena na analýzy monomerních polypeptidů s hmotnostním rozmezím od 14 000 do 100 000 daltonů. Hmotnostní rozmezí je možné rozšířit různými technikami (např. gradientové gely, zvláštní tlumivý systém), tyto techniky však nejsou předmětem této kapitoly.
Elektroforéza za denaturačních podmínek v polyakrylamidovém gelu s použitím dodecylsíranu sodného (SDS-PAGE) je nejrozšířenější způsob elektroforézy ke stanovení farmaceutické kvality bílkovinných výrobků a bude předmětem vzorové metody. Typická analytická elektroforéza bílkovin se provádí v polyakrylamidových gelech za podmínek zajišťujících rozštěpení bílkovin na jejich jednotlivé polypeptidové podjednotky a současně minimalizujících jejich shlukování. Nejčastěji se používá silně aniontový detergent dodecylsíran sodný (SDS) v kombinaci se zahříváním, při kterém se bílkoviny štěpí před jejich aplikací na gel. Denaturované polypeptidy váží SDS, stávají se záporně nabitými a vykazují stálý poměr náboj/hmotnost, bez ohledu na druh bílkoviny. Protože množství navázaného SDS je téměř vždy úměrné molekulové hmotnosti polypeptidu a je nezávislé na jeho sekvenci, SDS-polypeptidové komplexy migrují polyakrylamidovým gelem s pohyblivostí závislou na velikosti polypeptidu.
U všech výsledných detergent-polypeptidových komplexů se předpokládá stejný funkční vztah mezi jejich elektroforetickou pohyblivostí a molekulovou hmotností. Migrace SDS komplexů směrem k anodě probíhá předvídatelným způsobem, přičemž nízkomolekulární komplexy se pohybují rychleji než vysokomolekulární. Molekulová hmotnost bílkovin se může tudíž určovat z jejich relativní pohyblivosti v kalibrované SDS-PAGE a výskyt jednoho pruhu v takovémto gelu je kritériem čistoty.
Modifikace polypeptidového skeletu, jako je N- nebo O-glykosylace, má však významný vliv na zdánlivou molekulovou hmotnost bílkoviny, protože SDS se neváže na sacharidovou složku způsobem podobným polypeptidu, a tak není udržován stálý poměr náboje ke hmotnosti. Zdánlivá molekulová hmotnost bílkovin po posttranslačních modifikacích tedy není skutečným odrazem hmotnosti polypeptidového řetězce.
Redukční podmínky
Polypeptidové podjednotky a trojrozměrná struktura je v bílkovinách často udržována přítomností disulfidických vazeb. Cílem SDS-PAGE analýzy za redukčních podmínek je porušení této struktury redukcí disulfidických vazeb. Úplná denaturace a štěpení bílkovin působením 2-merkaptoethanolu nebo dithiothreitolu (DTT) vede k rozvinutí skeletu polypeptidu a jeho následné komplexaci s SDS. Za těchto podmínek může být molekulová hmotnost polypeptidových podjednotek počítána lineární regresí z molekulových hmotností přítomných vhodných standardů.
Neredukční podmínky
Pro některé analýzy není úplné štěpení bílkovin na peptidové podjednotky žádoucí. Nepůsobí-li se redukčními zkoumadly, jako je 2-merkaptoethanol nebo DTT, zůstávají disulfidické kovalentní vazby neporušeny a je zachována oligomerní forma bílkoviny. Oligomerní komplexy SDS-bílkovina se pohybují pomaleji než SDS-polypeptidové podjednotky. Kromě toho nemohou být neredukované bílkoviny kompletně nasyceny SDS, a tudíž nemohou vázat detergent v konstantním hmotnostním poměru. Tím je stanovení molekulové hmotnosti těchto molekul pomocí SDS-PAGE analýzy méně přesné než analýzy plně denaturovaných polypeptidů a je proto nezbytné, aby jak standardy tak neznámé bílkoviny byly pro platná srovnání v podobné konfiguraci. Nicméně zbarvení jediného pásu v takovém gelu je kritériem čistoty.
CHARAKTERISTIKY DISKONTINUÁLNÍHO TLUMIVÉHO SYSTÉMU GELOVÉ ELEKTROFORÉZY
Nejoblíbenější elektroforetickou metodou k charakterizaci komplexních směsí bílkovin je použití diskontinuálního tlumivého systému skládajícího se ze dvou stýkajících se, ale odlišných gelů: rozlišovacího neboli separačního gelu (dolního) a zaostřovacího (horního) gelu. Tyto dva gely jsou zhotoveny s odlišnou pórovistostí a obsahují roztoky o různém pH a iontové síle. Kromě toho v gelu a v elektrodových tlumivých roztocích se používají ionty s různou pohyblivostí. Diskontinuita tlumivých roztoků způsobuje zakoncentrování velkých objemů vzorků v zaostřovacím gelu a vede ke zlepšení rozlišení. Po zapnutí proudu se na zóně vzorku vytvoří spád napětí, jehož působením bílkoviny putují do zaostřovacího gelu. Glycinové ionty z elektrodového tlumivého roztoku následují bílkoviny do zaostřovacího gelu. Rychle se utvoří oblast pohybujícího se rozhraní s vysoce pohyblivými chloridovými ionty v čele a s relativně pomalými glycinovými ionty vzadu. Lokalizovaný vysokonapěťový gradient, tvořící se mezi zónami vedoucího a koncového iontu, způsobuje, že SDS-bílkovinné komplexy vytvářejí úzké zóny a migrují mezi zónami chloridů a glycinu.
V širokých limitech, bez ohledu na výšku zóny aplikovaného vzorku se všechny SDS-bílkoviny koncentrují do velmi úzké oblasti a vstupují do rozlišovacího gelu jako tenká, dobře definovaná zóna o vysoké hustotě bílkovin. Zaostřovací gel s velkými póry nezpomaluje migraci většiny bílkovin a slouží hlavně jako antikonvekční prostředí. Na rozhraní zaostřovacího a separačního gelu jsou bílkoviny silně zpomaleny vlivem omezené velikosti pórů separačního gelu. V rozlišovacím gelu jsou bílkoviny dále zpomalovány vlivem zesíťování matrice. Glycinové ionty předstihnou bílkoviny, které se pak pohybují v oblasti stálého pH tvořeného trometamolem a glycinem. Molekulární prosívání způsobuje, že se komplexy SDS-polypeptid oddělují na základě svých molekulových hmotností.
PŘÍPRAVA VERTIKÁLNÍCH SDS POLYAKRYLAMIDOVÝCH GELŮ S DISKONTINUÁLNÍMI TLUMIVÝMI ROZTOKY
Sestavení kazety pro odlévání gelu
Slabým detergentem se očistí a důkladně se opláchnou vodou dvě skleněné desky (např. o velikosti 10 cm × 8 cm), polytetrafluorethylenový hřeben, dva vymezovače a silikonová gumová hadice (např. o průměru 0,6 mm × 35 cm). Všechny části se osuší papírovým ubrouskem. Vymezovače a hadice se namažou nesilikonovým tukem. Vymezovače se aplikují podél každé ze dvou krátkých stran skleněné desky 2 mm od okrajů a 2 mm od dlouhé strany odpovídající spodní části gelu. Hadice se začne pokládat na skleněnou desku za použití jednoho vymezovače jako vodítka. Hadice se pečlivě svine na dně vymezovače a sleduje dlouhou stranu skleněné desky. Zatímco se přidržuje hadice jedním prstem podél dlouhé strany, hadice se opět stočí a položí se ke druhé krátké straně skleněné desky za použití druhého vymezovače jako vodítka. Druhá skleněná deska se umístí přesně nad první a forma se přitlačí rukou. Na každou ze dvou krátkých stran formy se umístí dvě svorky, na delší stranu gelové formy se pečlivě umístí čtyři svorky a takto se vytvoří dno gelové formy. Ověří se, že hadice prochází kolem okraje skleněných desek a nebyla vytlačena při umísťování svorek. Gelová forma je nyní připravena k nalití gelu.
Příprava gelu
V diskontinuálním tlumivém SDS polyalkrylamidovém gelu se doporučuje nejprve nalít separační gel, nechat jej zpolymerovat a poté nalít zaostřovací gel, neboť složení těchto dvou gelů se liší poměrem akrylamidbisakrylamidu, tlumivými roztoky a pH.
Příprava separačního (rozlišovacího) gelu
V kónické baňce se připraví vhodný objem roztoku obsahujícího požadovanou koncentraci akrylamidu pro separační gel za použití hodnot daných v tabulce 2.2.31-1. Složky se smísí v předepsaném pořadí. Pokud je třeba, roztok se před přidáním roztoku peroxodisíranu diamonného a tetramethyletnylendiaminu (TEMED) zfiltruje, je-li to nutné za použití vakua přes acetatcelulosovou membránu o velikosti pórů 0,45 μm; roztok se udržuje pod vakuem, filtrační jednotkou se krouží, až se v roztoku netvoří žádné bublinky. Přidá se vhodné množství roztoku peroxodisíranu diamonného a tetramethylethylendiaminu podle tabulky 2.2.31-1, krouživým pohybem se promíchá a ihned se nalije do mezery mezi dvěma skleněnými deskami formy. Nechá se dostačující prostor pro zaostřovací gel (délka zubů hřebenu plus 1 cm navíc). Za použití zúžené skleněné pipety se roztok opatrně převrství isobutanolem nasyceným vodou. Gel se ponechá ve vertikální poloze při teplotě místnosti zpolymerovat.
Příprava zaostřovacího gelu
Po úplné polymeraci (asi 30 min) se odlije isobutanol a horní část gelu se několikrát opláchne vodou, aby se odstranil zbytek isobutanolu a nezpolymerizovaný akrylamid. Z horní části gelu se odsaje co možná nejvíce kapaliny a poté se odstraní zbývající voda okrajem papírového ubrousku.
V kónické baňce se připraví vhodný objem roztoku obsahujícího požadovanou koncentraci akrylamidu za použití hodnot daných v tabulce 2.2.31-2. Složky se smísí v předepsaném pořadí. Je-li to vhodné, roztok se před přidáním roztoku peroxodisíranu diamonného a tetramethylethylendiaminu zfiltruje, je-li nutno za použití vakua přes acetatcelulosovou membránu o velikosti pórů 0,45 μm; roztok se udržuje pod vakuem, za občasného víření, kroužení filtrační jednotkou, až se v roztoku netvoří další bublinky. Přidá se vhodné množství roztoku peroxodisíranu diamonného a tetramethylethylendiaminu podle tabulky 2.2.31-2, krouživým pohybem se promíchá a ihned se nalije do mezery mezi dvěma skleněnými deskami formy přímo na povrch zpolymerovaného rozlišovacího gelu. Do zaostřovacího gelu se ihned vloží čistý polytetrafluorethylenový hřeben, přičemž se dbá na to, aby pod hřebenem nezůstaly vzduchové bublinky. Přidá se další roztok zaostřovacího gelu, aby se zcela zaplnily prostory hřebenu. Gel se nechá ve vertikální poloze při teplotě místnosti zpolymerovat.
Tab. 2.2.31-1 Příprava separačního gelu
| Složky roztoku | Objemy složek (ml) na objem gelové formy | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 5 ml | 10 ml | 15 ml | 20 ml | 25 ml | 30 ml | 40 ml | 50 ml | |
| 6% akrylamid | ||||||||
| voda R | 2,6 | 5,3 | 7,9 | 10,6 | 13,2 | 15,9 | 21,2 | 26,5 |
| roztok akrylamidu(1) | 1,0 | 2,0 | 3,0 | 4,0 | 5,0 | 6,0 | 8,0 | 10,0 |
| Tris 1,5 mol/l (pH 8,8)(2) | 1,3 | 2,5 | 3,8 | 5,0 | 6,3 | 7,5 | 10,0 | 12,5 |
| 100 g/l SDS(3) | 0,05 | 0,1 | 0,15 | 0,2 | 0,25 | 0,3 | 0,4 | 0,5 |
| 100 g/l APS(4) | 0,05 | 0,1 | 0,15 | 0,2 | 0,25 | 0,3 | 0,4 | 0,5 |
| TEMED(5) | 0,004 | 0,008 | 0,012 | 0,016 | 0,02 | 0,024 | 0,032 | 0,04 |
| 8% akrylamid | ||||||||
| voda R | 2,3 | 4,6 | 6,9 | 9,3 | 11,5 | 13,9 | 18,5 | 23,2 |
| roztok akrylamidu(1) | 1,3 | 2,7 | 4,0 | 5,3 | 6,7 | 8,0 | 10,7 | 13,3 |
| Tris 1,5 mol/l (pH 8,8)(2) | 1,3 | 2,5 | 3,8 | 5,0 | 6,3 | 7,5 | 10,0 | 12,5 |
| 100 g/l SDS(3) | 0,05 | 0,1 | 0,15 | 0,2 | 0,25 | 0,3 | 0,4 | 0,5 |
| 100 g/l APS(4) | 0,05 | 0,1 | 0,15 | 0,2 | 0,25 | 0,3 | 0,4 | 0,5 |
| TEMED(5) | 0,003 | 0,006 | 0,009 | 0,012 | 0,015 | 0,018 | 0,024 | 0,03 |
| 10% akrylamid | ||||||||
| voda R | 1,9 | 4,0 | 5,9 | 7,9 | 9,9 | 11,9 | 15,9 | 19,8 |
| roztok akrylamidu(1) | 1,7 | 3,3 | 5,0 | 6,7 | 8,3 | 10,0 | 13,3 | 16,7 |
| Tris 1,5 mol/l (pH 8,8)(2) | 1,3 | 2,5 | 3,8 | 5,0 | 6,3 | 7,5 | 10,0 | 12,5 |
| 100 g/l SDS(3) | 0,05 | 0,1 | 0,15 | 0,2 | 0,25 | 0,3 | 0,4 | 0,5 |
| 100 g/l APS(4) | 0,05 | 0,1 | 0,15 | 0,2 | 0,25 | 0,3 | 0,4 | 0,5 |
| TEMED(5) | 0,002 | 0,004 | 0,006 | 0,008 | 0,01 | 0,012 | 0,016 | 0,02 |
| 12% akrylamid | ||||||||
| voda R | 1,6 | 3,3 | 4,9 | 6,6 | 8,2 | 9,9 | 13,2 | 16,5 |
| roztok akrylamidu(1) | 2,0 | 4,0 | 6,0 | 8,0 | 10,0 | 12,0 | 16,0 | 20,0 |
| Tris 1,5 mol/l (pH 8,8)(2) | 1,3 | 2,5 | 3,8 | 5,0 | 6,3 | 7,5 | 10,0 | 12,5 |
| 100 g/l SDS(3) | 0,05 | 0,1 | 0,15 | 0,2 | 0,25 | 0,3 | 0,4 | 0,5 |
| 100 g/l APS(4) | 0,05 | 0,1 | 0,15 | 0,2 | 0,25 | 0,3 | 0,4 | 0,5 |
| TEMED(5) | 0,002 | 0,004 | 0,006 | 0,008 | 0,01 | 0,012 | 0,016 | 0,02 |
| 14% akrylamid | ||||||||
| voda R | 1,4 | 2,7 | 3,9 | 5,3 | 6,6 | 8,0 | 10,6 | 13,8 |
| roztok akrylamidu(1) | 2,3 | 4,6 | 7,0 | 9,3 | 11,6 | 13,9 | 18,6 | 23,2 |
| Tris 1,5 mol/l (pH 8,8)(2) | 1,2 | 2,5 | 3,6 | 5,0 | 6,3 | 7,5 | 10,0 | 12,5 |
| 100 g/l SDS(3) | 0,05 | 0,1 | 0,15 | 0,2 | 0,25 | 0,3 | 0,4 | 0,5 |
| 100 g/l APS(4) | 0,05 | 0,1 | 0,15 | 0,2 | 0,25 | 0,3 | 0,4 | 0,5 |
| TEMED(5) | 0,002 | 0,004 | 0,006 | 0,008 | 0,01 | 0,012 | 0,016 | 0,02 |
| 15% akrylamid | ||||||||
| voda R | 1,1 | 2,3 | 3,4 | 4,6 | 5,7 | 6,9 | 9,2 | 11,5 |
| roztok akrylamidu(1) | 5,0 | 7,5 | 10,0 | 12,5 | 15,0 | 20,0 | 25,0 | |
| Tris 1,5 mol/l (pH 8,8)(2) | 1,3 | 2,5 | 3,8 | 5,0 | 6,3 | 7,5 | 10,0 | 12,5 |
| 100 g/l SDS(3) | 0,05 | 0,1 | 0,15 | 0,2 | 0,25 | 0,3 | 0,4 | 0,5 |
| 100g/l APS(4) | 0,05 | 0,1 | 0,15 | 0,2 | 0,25 | 0,3 | 0,4 | 0,5 |
| TEMED(5) | 0,002 | 0,004 | 0,006 | 0,008 | 0,01 | 0,012 | 0,016 | 0,02 |
(1) Roztok 30% akrylamidu: akrylamid-bisakrylamid (29 : 1) RS
(2) Tris 1,5 mol/l (pH 8,8): tlumivý roztok trometamolový o pH 8,8 (1,5 mol/l)
(3) 100 g/l SDS: roztok dodecylsíranu sodného R (100 g/l)
(4) 100 g/l APS: roztok peroxodisíranu diamonného R (100 g/l). Peroxodisíran diamonný poskytuje volné radikály, které řídí polymerizaci akrylamidu a bisakrylamidu. Protože se roztok peroxodisíranu diamonného rozkládá pomalu, připravuje se každý týden čerstvý roztok.
(5) TEMED: tetramethylethylendiamin R
Tab. 2.2.31-2 Příprava zaostřovacího gelu
| Složky roztoku | Objemy složek (ml) na objem gelové formy | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 ml | 2 ml | 3 ml | 4 ml | 5 ml | 6 ml | 8 ml | 10 ml | |
| voda R | 0,68 | 1,4 | 2,1 | 2,7 | 3,4 | 4,1 | 5,5 | 6,8 |
| roztok akrylamidu(1) | 0,17 | 0,33 | 0,5 | 0,67 | 0,83 | 1,0 | 1,3 | 1,7 |
| Tris 1,0 mol/l (pH 6,8)(2) | 0,13 | 0,25 | 0,38 | 0,5 | 0,63 | 0,75 | 1,0 | 1,25 |
| 100 g/l SDS(3) | 0,01 | 0,02 | 0,03 | 0,04 | 0,05 | 0,06 | 0,08 | 0,1 |
| 100 g/l APS(4) | 0,01 | 0,02 | 0,03 | 0,04 | 0,05 | 0,06 | 0,08 | 0,1 |
| TEMED(5) | 0,001 | 0,002 | 0,003 | 0,004 | 0,005 | 0,006 | 0,008 | 0,01 |
(1) Roztok akrylamidu: akrylamid-bisakrylamid (29 : 1) 30% RS
(2) Tris 1,0 mol/l (pH 6,8): tlumivý roztok trometamolový o pH 6,8 (1 mol/l)
(3) 100 g/l SDS: roztok dodecylsíranu sodného R (100 g/l)
(4) 100 g/l APS: roztok peroxodisíranu diamonného R (100 g/l). Peroxodisíran diamonný poskytuje volné radikály, které řídí polymerizaci akrylamidu a bisakrylamidu. Protože se roztok peroxodisíranu diamonného rozkládá pomalu, připravuje se každý týden čerstvý roztok.
(5) TEMED: tetramethylethylendiaminu R
Umístění gelu do elektroforetického zařízení a elektroforetická separace
Po úplné polymeraci (asi 30 min) se opatrně odstraní polytetrafluorethylenový hřeben. Jamky se ihned vypláchnou vodou nebo SDS-PAGE elektrodovým roztokem R, aby se odstranil nezpolymerovaný akrylamid. Je-li to nutné, napřímí se zuby zaostřovacího gelu pomocí tupé hypodermické jehly připevněné k injekční stříkačce. Na krátké straně se odstraní svorky, opatrně se vytáhnou hadice a svorky se opět nasadí. Na druhé krátké straně se postupuje podobně. Odstraní se hadice i ze spodní části gelu. Kazeta s gelem se umístí do elektroforetického zařízení. Vrchní i spodní nádobka se naplní elektroforetickými tlumivými roztoky. Odstraní se všechny bubliny, které se zachytily na dně gelu mezi skleněnými deskami, nejlépe zahnutou hypodermickou jehlou připevněnou k injekční stříkačce. Nikdy se neprovádí preelektroforéza, tj. připojení napětí před aplikací vzorku, protože tím dochází k porušení diskontinuity tlumivých systémů.
Před aplikací vzorku se štěrbina mezi skly pečlivě opláchne SDS-PAGE elektrodovým roztokem RS. Připraví se zkoušený a kontrolní roztok v doporučeném vzorkovém tlumivém roztoku a upraví se, jak je specifikováno v jednotlivém článku. Aplikuje se vhodný objem jednotlivých vzorků do jamek zaostřovacího gelu. Elektroforéza se spustí podle podmínek doporučených výrobcem zařízení. Výrobci SDS-PAGE zařízení mohou dodávat gely různých rozměrů o různé tloušťce. Čas, po který elektroforéza probíhá, a aplikovaný proud, resp. napětí pro optimální dělení se mohou lišit podle výrobce zařízení. Ověří se, že barevné čelo se pohybuje směrem k separačnímu gelu. Přiblíží-li se barvivo ke dnu gelu, elektroforéza se zastaví. Kazeta s gelem se vyjme ze zařízení a oddělí se skleněné desky. Odstraní se vymezovače a zaostřovací gel a ihned se pokračuje barvením.
DETEKCE BÍLKOVIN V GELECH
Coomassie barvení je nejrozšířenější metoda barvení bílkovin s detekční úrovní řádu od 1 μg do 10 μg bílkoviny na pás. Barvení stříbrem je nejcitlivější metoda barvení bílkovin v gelech a může být detegován pás obsahující 10 ng až 100 ng.
Všechny kroky při barvení gelu se provádějí při teplotě místnosti jemným třepáním (např. na orbitální třepačce) ve vhodné nádobě. Při barvení gelů musí být použity rukavice, aby nedošlo k obarvení otisků prstů.
Coomassie barvení
Gel se ponoří do velkého přebytku barvicího roztoku modři kyselé 83 RS a nechá se stát nejméně 1 h. Pak se barvicí roztok odstraní.
Gel se odbarví velkým přebytkem odbarvovacího roztoku RS, který se několikrát vymění, až jsou obarvené pruhy bílkovin jasně rozlišitelné na čistém pozadí. Čím důkladněji je gel odbarven, tím menší množství bílkoviny může být detegováno. Odbarvování může být urychleno přidáním několika gramů anexu nebo malé houby do odbarvovacího roztoku RS.
POZNÁMKA: Kyselé roztoky používané v tomto procesu nefixují bílkoviny v gelu. Úplně to může vést ke ztrátě některých nízkomolekulárních bílkovin během barvení a odbarvování tenkých gelů. Stálé fixace se dosáhne tak, že se gel nechá stát ve směsi objemových dílů kyseliny trichloroctové R, methanolu R a vody R (1 + 4 + 5) po dobu 1 h před ponořením do barvicího roztoku modři kyselé RS.
Barvení stříbrem
Gel se ponoří do velkého přebytku fixačního roztoku R a nechá se stát po dobu 1 h. Fixační roztok R se odstraní, přidá se čerstvý fixační roztok R a inkubuje se nejméně 1 h nebo, je-li to vhodné, přes noc.
Fixační roztok R se odstraní a gel se promývá velkým přebytkem vody R po dobu 1 h. Gel se poté nechá nasáknout 15 min v roztoku glutaraldehydu R 1 % (V/V) a dvakrát po dobu 15 min se promývá ve velkém přebytku vody R, pak se nechá 15 min nasáknout ve tmě čerstvým zkoumadlem dusičnanu stříbrného R. Nakonec se gel třikrát po dobu 5 min promyje ve velkém přebytku vody R a ponoří se asi na 1 min do vyvíjecího roztoku R, dokud nedojde k uspokojivému obarvení. Vyvíjení se zastaví inkubací v blokovacím roztoku R po dobu 15 min a gel se opláchne vodou R.
SUŠENÍ OBARVENÝCH SDS POLYAKRYLAMIDOVÝCH GELŮ
V závislosti na použité barvicí metodě se s gely zachází poněkud odlišným způsobem. Při Coomassie barvení se po odbarvovacích krocích ponechá gel stát v roztoku glycerolu R (100 g/l) nejméně 2 h (je možná inkubace přes noc). Pro barvení stříbrem se ke konečnému oplachování přidá jeden krok - ponechání gelu 5 min v roztoku glycerolu R (20 g/l).
Dvě fólie porézního celulosového filmu se ponoří do vody R a inkubují se 5 min až 10 min. Jedna z fólií se umístí na sušicím rámečku. Gel se opatrně uchopí a položí se na celulosový film. Odstraní se všechny zachycené vzduchové bubliny a nalije se několik mililitrů vody R okolo okrajů gelu. Druhá fólie se umístí na gel shora a opět se odstraní zachycené vzduchové bubliny. Dokončí se sestavení sušicího rámečku, který se umístí v sušárně nebo se ponechá při pokojové teplotě, dokud se neusuší.
STANOVENÍ MOLEKULOVÉ HMOTNOSTI
Molekulové hmotnosti bílkovin se stanovují srovnáním jejich pohyblivostí s pohyblivostí několika standardů bílkovin o známých molekulových hmotnostech. Pro kalibrační gely jsou dostupné směsi bílkovin s přesně známými molekulovými hmotnostmi smíchané pro homogenní barvení. Lze je získat v různých rozmezích molekulových hmotností. Koncentrované zásobní roztoky bílkovin o známé molekulové hmotnosti jsou ředěny ve vhodném vzorkovém tlumivém roztoku a jsou aplikovány na stejný gel jako zkoumaný vzorek bílkoviny.
Okamžitě po ukončení elektromigrace se v gelu označí poloha značkovacího barviva bromfenolové modři, aby se identifikoval vedoucí okraj elektroforetického iontového čela. To může být provedeno tím, že se vystřihnou zářezy v koncích gelu nebo se vloží jehla s nasátým indickým inkoustem do gelu na čelo barviva. Po barvení se měří migrační vzdálenost každého bílkovinného pásu (standardů i neznámých bílkovin) od počátku separačního gelu. Migrační vzdálenost každé bílkoviny se dělí vzdáleností, kterou urazilo barvivo. Takto získané normalizované migrační vzdálenosti se nazývají relativní pohyblivosti bílkovin (relativní k čelu barviva) a jsou konvenčně označeny jako Rf. Sestrojí se křivka logaritmu relativních molekulových hmotností (Mr) standardů bílkovin jako funkce hodnot Rf. Graf je mírně sigmoidní. Neznámé molekulové hmotnosti mohou být určeny lineární regresní analýzou nebo interpolací z křivek log Mr proti Rf, pokud se hodnoty neznámých vzorků nacházejí v lineární části grafu.
VALIDACE ZKOUŠKY
Zkoušku lze hodnotit, jestliže bílkoviny standardů molekulových hmotností jsou rozloženy podél 80 % délky gelu a zahrnují požadované separační rozmezí (např. rozmezí pokrývající produkt a jeho dimer nebo produkt a jeho nečistoty) separace získané pro významné bílkovinné pásy, vykazující lineární vztah mezi logaritmem molekulové hmotnosti a Rf. Další validační požadavky s ohledem na zkoušený roztok mohou být specifikovány v příslušném článku.
KVANTIFIKACE NEČISTOT
Tam, kde je limit nečistot v článku specifikován, měl by být ředěním zkoušeného roztoku připraven kontrolní roztok, odpovídající dané úrovni nečistot. Např. pokud je limit 5 %, připraví se kontrolní roztok ředěním zkoušeného roztoku v poměru 1 : 20. Žádná nečistota (žádný pás jiný než hlavní pás) na elektroforeogramu získaného se zkoušeným roztokem nesmí být intenzivnější než hlavní pás získaný s kontrolním roztokem.
Za validačních podmínek by měly být nečistoty kvantifikovány normalizací k hlavnímu pásu za pomoci integračního densitometru. V tomto případě musí být odezvy validovány na linearitu.
“
3. V příloze části 2 Zkušební metody, kapitola 2.2 Fyzikální a fyzikálně-chemické metody se za kapitolu 2.2.41 doplňují kapitoly 2.2.42, 2.2.43 a 2.2.44, které znějí:
„
2.2.42 Hustota pevných látek
Hustota pevných látek odpovídá jejich průměrné hmotnosti vztažené na jednotku objemu a je obvykle vyjadřována v gramech na krychlový centimetr (g/cm3), ačkoliv mezinárodní jednotka je kilogram na krychlový metr (g/cm3 = 1000 kg/m3).
Na rozdíl od plynů a kapalin, jejichž hustota závisí jenom na teplotě a tlaku, hustota pevné částice závisí také na jejím molekulovém uspořádání, a proto se mění s krystalovou strukturou a stupněm krystalinity.
Je-li pevná částice amorfní nebo částečně amorfní, může její hustota záviset také na způsobu přípravy a zpracování.
Na rozdíl od kapalin mohou tedy být hustoty dvou chemicky ekvivalentních pevných látek různé, a tato různost odráží rozdíl ve struktuře pevného stavu. Hustota částic je důležitá fyzikální charakteristika pro farmaceutické použití.
Hustota pevné částice může dosahovat různých hodnot v závislosti na metodě použité k měření jejího objemu. Je užitečné rozlišovat tři úrovně vyjadřování hustoty:
- hustota krystalu, která zahrnuje pouze pevnou frakci materiálu; hustota krystalu je také nazývána pravá hustota,
- hustota částice, která zahrnuje také objem dutin uvnitř částice,
- celková hustota, která dále zahrnuje volný objem mezi částicemi, vytvořený ve vrstvě prášku; celková hustota se také nazývá zdánlivá hustota.
I. Hustota krystalu
Hustota krystalu látky je průměrná hmotnost vztažená na jednotku objemu (hmotnost objemové jednotky), s výjimkou všech dutin, které nejsou základní částí molekulového uspořádání. Je to vnitřní vlastnost látky a měla by být proto nezávislá na metodě stanovení. Hustota krystalu může být zjištěna buď výpočtem, nebo jednoduchým měřením.
A. Vypočítaná hustota krystalu se získá s použitím krystalografických dat (velikost a složení základní buňky) dokonalého krystalu, např. z rentgenových difrakčních dat, a molekulové hmotnosti látky.
B. Změřená hustota krystalu je poměr hmotnosti a objemu po změření těchto hodnot u monokrystalu.
Přihlaste se pro poznámky, oblíbené a upozornění
Informace o předpisu
| Citace | Vyhláška Ministerstva zdravotnictví č. 48/2001 Sb., kterou se mění vyhláška Ministerstva zdravotnictví č. 1/1998 Sb., kterou se stanoví požadavky na jakost, postup při přípravě, zkoušení, uchovávání a dávkování léčiv (Český lékopis 1997), ve znění vyhlášky č. 296/1999 Sb. |
|---|---|
| Typ předpisu | Vyhláška |
| Autor | - |
| Sbírka | Sbírka zákonů |
| Datum vyhlášení | 15.02.2001 |
|---|---|
| Účinnost od | 15.02.2001 |
| Účinnost do | - |
| Stav | Platný |
Znění předpisu má informativní charakter.
Komentáře 0