Указ No 328 / 2008 Кол.
Указ про внесення змін до Указу No 331 / 2004 Coll., про заходи щодо забезпечення захисту від введення та поширення агента з картоплі та бактеріального коричневого рота агента
Чинний
Замовити
Чинний від 02.09.2008
Версії тексту:
02.09.2008
Zobrazeno prvních 200 z celkem 1531 ustanovení tohoto předpisu.
Zobrazit celý předpis →
Pro stažení celého znění použijte tlačítko Stáhnout výše.
328
VYHLÁŠKA
ze dne 19. srpna 2008,
kterou se mění vyhláška č. 331/2004 Sb., o opatřeních k zabezpečení ochrany proti zavlékání a šíření původce bakteriální kroužkovitosti bramboru a původce bakteriální hnědé hniloby
Ministerstvo zemědělství stanoví podle § 88 odst. 2 zákona č. 326/2004 Sb., o rostlinolékařské péči a o změně některých souvisejících zákonů, ve znění zákona č. 131/2006 Sb. a zákona č. 249/2008 Sb., (dále jen „zákon“) k provedení § 71 odst. 1 písm. h) zákona:
Vyhláška č. 331/2004 Sb., o opatřeních k zabezpečení ochrany proti zavlékání a šíření původce bakteriální kroužkovitosti bramboru a původce bakteriální hnědé hniloby, se mění takto:
1. § 1 včetně poznámky pod čarou č. 1 zní:
Předmět úpravy
Tato vyhláška zapracovává příslušné předpisy Evropských společenství1) a upravuje opatření, která se uplatňují na území České republiky proti šíření Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. subsp. sepedonicus (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al., původci bakteriální kroužkovitosti bramboru, a Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., původci bakteriální hnědé hniloby, aby se
a) zabránilo výskytu a šíření,
b) zjistilo místo výskytu a rozsah rozšíření a
c) při zjištění výskytu se zabránilo jejich šíření a prováděla se ochranná opatření s cílem jejich eradikace.
1) Směrnice Rady 93/85/EHS ze dne 4. října 1985 o ochraně proti bakteriální kroužkovitosti bramboru. Směrnice Rady 98/57/ES ze dne 20. července 1998 o ochraně proti Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. Směrnice Komise 2006/56/ES ze dne 12. června 2006, kterou se mění přílohy směrnice Rady 93/85/EHS. Směrnice Komise 2006/63/ES ze dne 14. července 2006, kterou se mění přílohy II až VII směrnice Rady 98/57/ES.“.
2. V § 2 písm. k) bodu 1 se na konci textu bodu 1 doplňují slova „v případě rajčete rostliny, které vyrostly ze stejné partie osiva,“.
3. V § 3 odst. 2 písm. a) poznámka pod čarou č. 2 zní:
„2) § 2 odst. 1 písm. b) zákona č. 219/2003 Sb., o uvádění do oběhu osiva a sadby pěstovaných rostlin a o změně některých zákonů, ve znění pozdějších předpisů.“.
4. V § 3 odst. 4 písm. a) se slovo „bramboru“ nahrazuje slovem „bramboru2)“.
5. V § 4 odst. 2 poznámka pod čarou č. 3 zní:
„3) § 31 odst. 2 vyhlášky č. 215/2008 Sb., o opatřeních proti zavlékání a rozšiřování škodlivých organismů rostlin a rostlinných produktů.“.
6. V § 6 odst. 1 se slovo „materiálu“ nahrazuje slovem „materiálu2),“.
7. V § 7 odst. 1 písmeno b) zní:
„b) partie hostitelských rostlin označená jako pravděpodobně zamořená podle § 5 odst. 1 písm. b) smí být použita pod dohledem rostlinolékařské správy způsobem uvedeným v bodě 2, popřípadě 3 přílohy č. 4, pokud rostlinolékařská správa předem ověří, že neexistuje rozpoznatelné riziko rozšíření původce kroužkovitosti nebo původce hnědé hniloby a že jsou splněny požadavky na zneškodňování odpadů, stanovené v příloze č. 5, v případě průmyslového zpracování této partie, a pokud není tato partie na základě výsledku testování klonově příbuzných partií hostitelských rostlin podle § 6 označena jako zamořená podle § 5 odst. 1 písm. a),“.
8. V § 8 odst. 2 písm. a) poznámka pod čarou č. 4 zní:
„4) § 2 odst. 1 písm. o) zákona č. 219/2003 Sb., o uvádění do oběhu osiva a sadby pěstovaných rostlin a o změně některých zákonů, ve znění pozdějších předpisů.“.
9. V § 8 odst. 2 písm. c) se za slova „nebo předstupňů,“ vkládají slova „nebo všech partií rozmnožovacího materiálu bramboru určených k množení v následujícím roce,“.
10. Příloha č. 1 zní:
„Příloha č. 1 k vyhlášce č. 331/2004 Sb.
A. METODY DIAGNÓZY, DETEKCE A IDENTIFIKACE PŮVODCE KROUŽKOVITOSTI
Předložené postupové diagramy popisují různé postupy, které jsou součástí:
i) diagnózy kroužkovitosti v hlízách bramboru a rostlinách bramboru,
ii) detekce Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus ve vzorcích hlíz bramboru a rostlin bramboru,
iii) identifikace Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.
OBECNÉ ZÁSADY
Optimalizované protokoly pro různé metody, validovaná činidla a podrobnosti pro přípravu testovaných a kontrolních materiálů jsou uvedeny v dodatcích. Seznam laboratoří, které se podílely na optimalizaci a validaci protokolů, je v dodatku č. 1.
Protože protokoly obsahují zjištění karanténního organismu a zahrnují použití životaschopných kultur Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus jako kontrolních materiálů, je nutné pracovat za vhodných karanténních podmínek s odpovídajícím zařízením na odstraňování odpadů a za podmínek příslušných povolení vydaných rostlinolékařskou správou.
Testovací parametry musí zajistit stálé a reprodukovatelné zjištění úrovní Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus jako stanovené prahy vybraných metod.
Zcela nezbytná je příprava pozitivních kontrol.
Testování podle požadovaných prahů také zahrnuje správné nastavení, údržbu a kalibraci zařízení, pečlivé zacházení s činidly a jejich uchovávání a všechna opatření pro zamezení kontaminace mezi vzorky, např. oddělení pozitivních kontrol od testovaných vzorků. Musí být uplatněno standardní řízení kvality, aby se zabránilo administrativním a jiným chybám, zvláště při označování a v dokumentaci.
Podezření z výskytu, jak je uvedeno v § 4 odst. 1, naznačuje pozitivní výsledek z diagnostických nebo screeningových testů provedených na vzorku, jak je znázorněno v níže uvedených postupových diagramech.
Pokud je první screeningový test (IF nebo PCR/FISH) pozitivní, existuje podezření na infekci původcem kroužkovitosti a musí být proveden druhý screeningový test. Pokud je i druhý screeningový test pozitivní, pak je podezření z výskytu potvrzeno a musí se pokračovat v testování podle daného schématu. Pokud je druhý screeningový test negativní, pak vzorek není považován za infikovaný původcem kroužkovitosti.
Z toho důvodu je pozitivní IF test podle § 4 odst. 1 definován jako pozitivní výsledek IF testu potvrzený druhým screeningovým testem (PCR/FISH).
Potvrzená přítomnost vyžaduje izolaci a identifikaci čisté kultury Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus s potvrzením patogenity.
1. Použití postupových diagramů
1.1. Postupový diagram pro diagnózu bakteriální kroužkovitosti v hlízách bramboru a v rostlinách bramboru vykazujících příznaky bakteriální kroužkovitosti
Postup testování je určen pro hlízy a rostliny bramboru s podezřením z výskytu nebo typickými příznaky kroužkovitosti. Zahrnuje rychlý screeningový test, izolaci patogenu z infikovaného vodivého pletiva na diagnostickém médiu a v případě pozitivního výsledku identifikaci kultury Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.
(1) Popis příznaků je v oddíle 2.
(2) Vhodné testy jsou: - IF test (oddíl 4), - PCR test (oddíl 6), - FISH test (oddíl 5).
(3) Ačkoli izolace patogena z rostlinného materiálu s typickými příznaky roztíráním suspenzí na média není komplikovaná, kultivace v pokročilých stádiích infekce se nemusí podařit. Saprofytické bakterie, které rostou na infikovaném pletivu, mohou přerůst nebo potlačovat patogena na izolačním médiu. Proto se doporučuje používat neselektivní i selektivní média, nejlépe MTNA (oddíl 8) nebo biotest (oddíl 7).
(4) Popis typické morfologie kolonie je v oddíle 8.
(5) Pokud je izolační zkouška negativní, ale příznaky choroby jsou typické, musí být izolace provedena znovu.
(6) Spolehlivé identifikace čisté kultury Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus se dosáhne za použití testů uvedených v oddílu 9.
(7) Zkouška patogenity je popsána v oddíle 10.
1.2. Postupový diagram pro diagnózu bakteriální kroužkovitosti ve vzorcích bezpříznakových hlíz bramboru
Postup testování je určen ke zjištění latentních infekcí v hlízách bramboru. Pozitivní výsledek z nejméně dvou screeningových testů, z nichž každý je založen na jiném biologickém principu, musí být doplněn izolací patogena, a následně, v případě izolace typických kolonií, potvrzením, že čistá kultura je Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Pozitivní výsledek pouze jednoho screeningového testu není dostačující k tomu, aby byl vzorek považován za podezřelý.
Screeningové a izolační testy musí umožnit detekční práh 103 až 104 buněk/ml resuspendované pelety zahrnutý jako pozitivní kontroly v každé sérii testů.
(1) Standardní velikost vzorku je 200 hlíz, ačkoli postup lze použít i na menší počet, jestliže 200 hlíz není k dispozici.
(2) Metody extrakce a koncentrace patogena jsou popsány v oddílu 3.1.
(3) Pokud jsou alespoň dva testy založené na různých biologických principech pozitivní, musí být provedena izolace a potvrzení. Provede se nejméně jeden screeningový test. Pokud je tento test negativní, je vzorek považován za negativní. V případě, že je tento test pozitivní, je pro ověření prvního pozitivního výsledku nezbytný ještě jeden nebo více screeningových testů založených na různých biologických principech. Pokud je druhý nebo další test negativní, je vzorek považován na negativní. Další testy nejsou nutné.
(4) Test imunofluorescence (IF). Pro vyšetření IF se vždy použije polyklonální protilátka, další monoklonální protilátky umožní větší přesnost (viz oddíl 4).
(5) PCR test. Použijí se vhodná validovaná PCR činidla a protokoly (viz oddíl 6).
(6) FISH test. Použijí se validovaná činidla a protokoly (viz oddíl 5).
(7) Selektivní izolace. Toto může být v mnoha případech vhodná metoda pro přímou izolaci Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus za použití MTNA média nebo NCP-88 média a ředění resuspendované pelety 1/100. Typické kolonie lze získat během 3-10 dní po rozetření na médium. Kulturu patogena lze následně vyčistit a identifikovat. Pro úplné využití potenciálu test vyžaduje opatrnou přípravu pletiva z pupkové části, aby se omezily sekundární bakterie, které jsou konkurencí Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus na médiu a které mohou patogena přerůst. Pokud se kultivační metoda takto nepodaří, musí být izolace provedena z rostlin použitých pro biotest (viz oddíl 8).
(8) Biotest se používá k izolaci Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus z pelet bramborových extraktů pomocí selektivního obohacení v rostlinách lilku vejcoplodého (Solanum melongena). Test vyžaduje optimální inkubační podmínky stanovené pro tuto metodu. Bakteriální inhibitory Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus na MTNA nebo NCP-88 médiu pravděpodobně tento test narušovat nebudou (viz oddíl 7).
(9) Typická morfologie kolonie je popsána v oddílu 8.
(10) Kultivace nebo biotesty mohou selhat z důvodů konkurence nebo inhibice saprofytickými bakteriemi. Pokud jsou výsledky screeningových testů pozitivní, ale izolační testy negativní, opakují se izolační testy ze stejné pelety nebo dodatečným odebráním vodivého pletiva z blízkosti pupkového konce hlíz stejného vzorku a v případě potřeby se provede test dalších vzorků.
(11) Spolehlivá identifikace čistých kultur podezřelých na Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus se dosáhne použitím testů popsaných v oddílu 9.
(12) Test patogenity je popsán v oddílu 10.
1.3. Postupový diagram pro diagnózu bakteriální kroužkovitosti ve vzorcích bezpříznakových rostlin bramboru
(1) Doporučené velikosti vzorků – viz oddíl 3.2.
(2) Metody extrakce a koncentrace patogena jsou popsány v oddílu 3.2.
(3) Pokud jsou alespoň dva testy založené na různých biologických principech pozitivní, musí být provedena izolace a potvrzení. Provede se nejméně jeden screeningový test. Pokud je tento test negativní, je vzorek považován za negativní. V případě, že je tento test pozitivní, je pro ověření prvního pozitivního výsledku nezbytné provedení druhého nebo více screeningových testů založených na různých biologických principech. Pokud je druhý nebo další test negativní, je vzorek považován za negativní. Další testy nejsou nutné.
(4) Selektivní izolační test a typická morfologie kolonie jsou popsány v oddílu 8.
(5) IF test je popsán v oddílu 4.
(6) PCR test je popsán v oddílu 6.
(7) FISH test je popsán v oddílu 5.
(8) Biotest je popsán v oddílu 7.
(9) Kultivace nebo biotest mohou selhat z důvodů konkurence nebo inhibice saprofytickými bakteriemi. Pokud jsou výsledky screeningových testů pozitivní, ale izolační testy jsou negativní, opakují se izolační testy a v případě potřeby se provede test dalších vzorků.
(10) Spolehlivé identifikace čistých kultur, u kterých je podezření, že se jedná o Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, se dosáhne pomocí testů popsaných v oddílu 9.
(11) Test patogenity je popsán v oddílu 10.
2. Vizuální vyšetření na přítomnost příznaků kroužkovitosti
2.1. Rostliny bramboru
V evropských klimatických podmínkách se příznaky na poli zjistí jen zřídkakdy a často pak až na konci sezóny. Kromě toho jsou příznaky skryté nebo se zamění s příznaky jiných chorob, stáří nebo mechanických poškození. Proto mohou být příznaky při kontrole na poli snadno přehlédnuty. Příznaky vadnutí jsou velmi odlišné od příznaků hnědé hniloby; vadnutí je obvykle pomalé a zpočátku omezené na okraje listů. Mladé infikované listy často i přes infekci nadále rostou, i když růst v infikovaných místech je omezený. Tím vznikají neobvykle tvarované listy. Listy postižené ucpáním vodivých pletiv na spodní části stonku často mají chlorotické, žluté až oranžové mezižeberní partie. Infikované děložní lístky, listy a dokonce stonky mohou eventuálně odumřít. Často jsou listy a hlízy pouze menší. Příležitostně jsou rostliny zakrnělé. Barevné snímky řady příznaků jsou na internetové stránce http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.
2.2. Hlízy bramboru
Nejranějšími příznaky jsou slabá sklovitost nebo průsvitnost pletiva bez měknutí v okolí cévního systému, zejména blízko pupku. Prstenec svazků cévních na pupkovém konci hlízy může mít nepatrně tmavší zbarvení než obvykle. Prvním dobře identifikovaným příznakem je žlutavé zabarvení prstence cévních svazků a stav, kdy při jemném zmáčknutí hlízy vystupují z cév sloupky sýrovité hmoty. Tento exsudát obsahuje miliony bakterií. Vodivá pletiva mohou zhnědnout a příznaky na hlízách jsou v tomto stádiu podobné příznakům hnědé hniloby způsobené Ralstonia solanacearum. Zpočátku mohou být tyto příznaky omezeny na jednu část prstence, nemusí se vyskytovat jen blízko pupkové části a mohou se postupně šířit na celý prstenec. S postupem infekce dochází k destrukci vodivých pletiv: vnější korová část se může oddělit od vnitřní korové části. V pokročilých stadiích infekce se objevují na povrchu hlízy praskliny, často s červenohnědými okraji. V poslední době se v Evropě objevilo několik případů, kdy střední kůra hnije s prstencem svazků cévních, čímž dochází k druhotnému poškození se vznikem vnitřních dutin a nekrózy. Druhotná houbová nebo bakteriální infekce může příznaky maskovat a může být obtížné, ne-li nemožné, rozlišit pokročilé příznaky kroužkovitosti od jiných hnilob bramboru. Možné jsou i atypické příznaky. Barevné snímky řady příznaků jsou na internetové stránce http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.
3. Příprava vzorků
3.1. Hlízy bramboru
Poznámka:
- Standardní velikost vzorku je 200 hlíz na 1 test. Intenzivnější vzorkování vyžaduje více testů na vzorcích této velikosti. Větší množství hlíz ve vzorku vede k zpomalení nebo složitějšímu výkladu výsledků. Postup však lze vhodně použít i pro vzorky s méně než 200 hlízami, pokud je k dispozici menší množství hlíz.
- Validace všech níže uvedených zjišťovacích metod je založená na testování vzorků o velikosti 200 hlíz.
- Níže popsaný bramborový extrakt lze použít také pro zjištění původce hnědé hniloby, Ralstonia solanacearum.
Nepovinné ošetření před přípravou vzorku:
Hlízy se omyjí. Použijí se vhodné dezinfekční prostředky (s obsahem chlóru, jestliže má být proveden PCR test, pro odstranění možné patogenní DNA) a mycí prostředky mezi každým vzorkem. Hlízy se nechají oschnout na vzduchu. Tento postup mytí je obzvlášť užitečný v případě, že je ve vzorku příliš zeminy a jestliže se má provádět PCR test nebo přímá izolace.
3.1.1. Pomocí čistého a dezinfikovaného skalpelu nebo nožem či škrabkou na brambory se odstraní slupka na pupkovém konci každé hlízy. Opatrně se vyříznou konické výkrojky vodivého pletiva z pupkových konců brambor. Na minimum se omezí nadbytečná část pletiva nezahrnující cévní svazky. Po odebrání musí být výkrojky z pupkových konců zpracovány do 24 hodin nebo konzervovány při -20 °C po dobu nejdéle dvou týdnů.
Všechny hlízy s podezřelými příznaky bakteriální kroužkovitosti se dají stranou a testují se odděleně.
Pokud jsou při vyříznutí výkrojku z pupkového konce zjištěny příznaky kroužkovitosti, provede se vizuální vyšetření této hlízy po naříznutí hlízy na pupkovém konci. Všechny naříznuté hlízy s podezřelými příznaky se nechají korkovatět po dobu 2 dnů při pokojové teplotě a uchovávají se v karanténě při teplotě 4 – 10 °C až do ukončení všech testů. Všechny hlízy ve vzorku se uchovávají podle přílohy č.2.
3.1.2. Výkrojky z pupkové části se shromáždí v nepoužitých nádobách na jedno použití, které jsou uzavíratelné a/nebo utěsnitelné (v případě, že jsou nádoby znovu používány, musí být důkladně vyčištěny a dezinfikovány prostředky s obsahem chlóru). Nejlépe je zpracovat výkrojky z pupkového konce okamžitě, pokud to není možné, uchovávají se v nádobě bez přidání pufru, v chladu po dobu maximálně 72 hodin nebo při pokojové teplotě maximálně 24 hodin. Schnutí a suberizace výkrojků a růst saprofytů v průběhu skladování může bránit zjištění přítomnosti bakterie způsobující kroužkovitost.
3.1.3. Výkrojky z pupkového konce se zpracují jedním z následujících postupů:
a) výkrojky se zalijí dostatečným množstvím (přibližně 40 ml) extrakčního pufru (dodatek 3) a třepají se v rotační třepačce (50-100 ot/min) po dobu 4 hodin při teplotě nižší než 24 °C nebo po dobu 16-24 hodin chlazené;
nebo
b) výkrojky se homogenizují s dostatečným množstvím (přibližně 40 ml) extrakčního pufru (dodatek 3), buď v mixéru nebo rozdrcením v utěsněném jednorázovém maceračním sáčku za použití gumového tloučku nebo vhodného mlecího zařízení.
Poznámka:
Při homogenizaci vzorků za použití mixéru existuje vysoké nebezpečí křížové kontaminace vzorků. Je nutno učinit bezpečnostní opatření pro zamezení vzniku aerosolu nebo rozlití během extrakce. Pro každý vzorek musí být použita čerstvě sterilizovaná ostří (nože) a nádoby. Pokud má být použit PCR test, je nutno zamezit přenosu DNA na nádoby nebo mlecí zařízení, doporučuje se drcení v sáčcích na jedno použití a použití zkumavky na jedno použití.
3.1.4. Dekantuje se supernatant. Pokud je nadměrně zakalený, pročistí se buď pomalým odstředěním (při maximálně 180 g po dobu 10 minut při teplotě 4-10°C) nebo vakuovou filtrací (40-100μm), filtr se omyje přídavkem (10 ml) extrakčního pufru (dodatek 3).
3.1.5. Bakteriální frakce se zahustí odstřeďováním při 7000 g po dobu 15 minut (nebo 10 000 g po dobu 10 minut) při teplotě 4-10°C a odstraní se supernatant, aniž by se rozvířila peleta.
3.1.6. Resuspenduje se peleta v 1,5 ml peletového pufru (dodatek 3). Použije se 500 μl pro test na Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, 500 μl pro Ralstonia solanacearum a 500 μl pro referenční účely. Přidá se sterilní glycerol na konečnou koncentraci 10-25 % (v/v) k 500 μl referenční poměrné části a ke zbývající části vzorku, promíchá se vířením a uloží při teplotě -16 až -24°C (týdny) nebo při teplotě -68 až -86°C (měsíce). Extrakty se během testování uchovávají při teplotě 4-10°C.
Opakované zmrazení a rozmrazení se nedoporučuje.
Pokud je nutný transport extraktu, zajistí se přeprava v chladícím boxu do 24 až 48 hodin.
3.1.7. Je nezbytně nutné, aby se se všemi pozitivními kontrolami a vzorky Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus zacházelo odděleně, aby se předešlo kontaminaci. To platí i pro sklíčka na IF testy a všechny testy.
3.2. Rostliny bramboru
Poznámka:
Pro zjištění latentních populací Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus se doporučuje kontrola kombinovaných vzorků. Postup je vhodný pro kombinované vzorky až 200 částí stonků. (Pokud se provádí podrobné průzkumy, měly by být založeny na statisticky reprezentativním vzorku rostlinné populace, která je předmětem vyšetřování.)
3.2.1 Pomocí čistého dezinfikovaného nože nebo zahradnických nůžek se odstraní část o velikosti 1-2 cm ze spodní strany každého stonku přímo nad povrchem země.
Části stonků se krátce dezinfikují etanolem 70 %, okamžitě osuší savým papírem a shromažďují v uzavřené sterilní nádobě.
3.2.2. Části stonků se zpracují jedním z následujících postupů:
a) části se zalijí dostatečným množstvím (přibližně 40 ml) extrakčního pufru (dodatek 3) a třepají v rotační třepačce (50-100 ot/min) po dobu 4 hodin při teplotě nižší než 24 °C nebo po dobu 16-24 hodin chlazené,
nebo
b) části se okamžitě rozdrtí v pevném maceračním sáčku s přiměřeným množstvím extrakčního pufru (dodatek 3) za použití gumového tloučku nebo vhodného mlecího zařízení. Pokud to není možné, skladují se části stonků v chladu maximálně 72 hodin nebo maximálně 24 hodin při pokojové teplotě.
3.2.3. Po usazení, které má trvat 15 minut, se dekantuje supernatant.
3.2.4 Další purifikace extraktu nebo koncentrace bakteriální frakce obvykle není nutná, ale lze ji dosáhnout filtrací a/nebo odstředěním podle popisu v oddílu 3.1.3.-3.1.6.
3.2.5 Čistý nebo koncentrovaný vzorkový extrakt se rozdělí na 2 stejné části, Jedna polovina se udržuje během testování při teplotě 4-10 °C a druhá polovina se skladuje s 10-25 % (v/v) sterilního glycerolu při teplotě -16 až -24 °C (týdny) nebo při teplotě -68 až -86 °C (měsíce), pokud je nutné další testování.
4. IF test
PRINCIP
Doporučuje se použít IF test jako hlavní screeningový test, protože byla prokázána jeho schopnost dosáhnout požadovaných prahů.
Použije-li se jako hlavní screeningový test a jeho výsledek je pozitivní, musí být jako druhý screeningový test proveden test PCR nebo FISH. Jestliže se test IF použije jako druhý screeningový test a jeho výsledek je pozitivní, je pro dokončení analýzy nutné další testování podle postupového diagramu.
Poznámka:
Pokud je IF test používán jako hlavní vyšetřovací test, používá se vždy polyklonální protilátka. V případě pozitivního výsledku IF testu s polyklonální protilátkou může být další vyšetření vzorku s monoklonální protilátkou přesnější, ale méně citlivé.
Používají se protilátky proti známému kmenu původce kroužkovitosti - ATCC33113 (NCPPB 2137) nebo NCPPB 2140. Doporučuje se určovat titr pro každou novou řadu protilátek. Titr je stanoven jako nejvyšší ředění, při kterém dochází k optimální reakci při testování suspenze obsahující 105 až 106 buněk na 1 ml homologického kmene původce kroužkovitosti a při použití vhodného konjugátu fluorescenčního isothiokyanatanu (FITC) podle doporučení výrobce. Nezpracované polyklonální nebo monoklonální protilátky by měly mít IF titr alespoň 1:2000. Během testu by se měly protilátky používat v pracovním ředění (WD) v blízkosti titru nebo na titru. Používají se validované protilátky (viz internetovou stránku http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.
Test se provádí na čerstvě připravených vzorkových extraktech. V případě potřeby může být úspěšně proveden na extraktech skladovaných při - 68 až - 86 °C v glycerolu. Glycerol lze ze vzorku odstranit přidáním 1 ml peletového pufru (dodatek 4), opětovným odstředěním po dobu 15 minut při 7 000 g a resuspenzí ve stejném množství peletového pufru. To často není nutné, zejména pokud jsou sklíčka se vzorky fixována plamenem (viz 4.2).
Připraví se oddělená pozitivní kontrolní sklíčka s homologickým kmenem nebo s jiným srovnávacím kmenem původce kroužkovitosti, suspendovaným ve výluhu z brambor podle dodatku 2 a nepovinně v pufru.
Pletivo infikované přirozenou cestou (uchovávané lyofilizací nebo zmrazením při teplotě -16 až -24 °C) by se mělo podle možnosti použít jako paralelní kontrola na stejném podložním sklíčku.
Jako negativní kontroly se použijí alikvotní části vzorkových extraktů, které byly předtím testovány s negativním výsledkem.
Použijí se mikroskopická sklíčka s více okénky, nejlépe s 10 okénky o průměru nejméně 6 mm.
Test kontrolního materiálu se provede stejným způsobem jako test vzorků.
4.1. Sklíčka na test se připraví jedním z následujících postupů:
a) Pro pelety s relativně nízkým množstvím škrobového sedimentu:
Napipetuje se měřené standardní množství (pro okénka o průměru 6 mm je vhodné 15 μl – pro větší okénka objem vyšší) roztoku resuspendované bramborové pelety 1/100 do prvního okénka. Následně se napipetuje stejné množství nezředěné pelety (1/1) do zbývajících okének v řadě. Druhou řadu lze použít jako duplikát nebo pro druhý vzorek podle obrázku 1.
b) Pro jiné pelety:
Připraví se desetinná ředění (1/10 a 1/100) resuspendované pelety v peletovém pufru. Napipetuje se měřené standardní množství (pro okénka o průměru 6 mm je vhodné 15 μl – pro větší okénka objem vyšší) resuspendované pelety 1/100 a každého roztoku do řady okének. Druhou řadu lze použít jako duplikát nebo pro druhý vzorek podle obrázku 2.
4.2. Vysuší se kapky při pokojové teplotě nebo zahřátím na teplotu 40 až 45 °C. Bakteriální buňky se fixují na sklíčko buď zahřátím (15 minut při teplotě 60 °C), nad plamenem nebo pomocí 95 % etanolu nebo podle zvláštních pokynů dodavatelů protilátek.
V případě potřeby lze potom fixovaná sklíčka před dalším použitím skladovat zmrazená v suchém boxu po co možná nejkratší dobu (maximálně 3 měsíce).
4.3. Postup IF testu:
a) Podle přípravy sklíčka na test v oddílu 4.1 písm. a):
Připraví se sada dvojnásobných roztoků protilátky v IF pufru. V první jamce by měl být titr ½ (T/2), v ostatních titr ¼ (T/4), titr ½ (T/2), titr (T) a dvojnásobný titr (2T).
b) Podle přípravy sklíčka na test v oddílu 4.1 písm. b):
Připraví se pracovní ředění (WD) protilátky v IF pufru. Pracovní ředění ovlivňuje přesnost.
Obrázek 1: Příprava sklíčka na test podle oddílu 4.1. písm. a) a oddílu 4.3. písm. a)
Obrázek 2: Příprava sklíčka na test podle oddílu 4.1. písm. b) a oddílu 4.3 b)
4.3.1. Podložní sklíčka se uspořádají na navlhčený papír. Každé testovací okénko se pokryje kompletně ředěním protilátek. Množství protilátky na každém okénku musí být nejméně stejné jako množství použitého extraktu.
Pokud nejsou k dispozici konkrétní pokyny od dodavatele protilátek, postupuje se následovně:
4.3.2. Podložní sklíčka se inkubují na vlhkém papíře přikrytá po dobu 30 minut při pokojové teplotě (18-25 °C).
4.3.3. Setřesou se kapky ze všech podložních sklíček a tato se pečlivě opláchnou pufrem IF. Umyjí se ponořením po dobu 5 minut v pufru IF Tween (dodatek 3) a následně v pufru IF. Je třeba zabránit vzniku aerosolu nebo přenosu kapiček, které by mohly způsobit vzájemnou kontaminaci, a pečlivě odstranit přebytečnou vlhkost jemným osušením.
4.3.4. Sklíčka se umístí na vlhký papír. Testovací okénka se pokryjí ředěním konjugátu FITC, kterým se stanovuje titr. Množství konjugátu naneseného do okének musí být stejné jako množství použité protilátky.
4.3.5. Zakrytá sklíčka se inkubují na vlhkém papíru po dobu 30 minut při pokojové teplotě (18-25 °C).
4.3.6. Kapky konjugátu se setřesou ze sklíček a tato se opláchnou a umyjí jako předtím (4.3.3.).
Opatrně se odstraní přebytečná vlhkost.
4.3.7. Napipetuje se 5-10 μl 0,1M fosfátového pufru s glycerolem (dodatek 3) nebo komerční krycí tekutiny do každého okénka a přiloží krycí sklíčko.
4.4. Vyhodnocení IF testu
4.4.1. Testovací sklíčka se prohlížejí epifluorescenčním mikroskopem s filtry vhodnými pro excitaci FITC pod olejovou nebo vodní imersí při zvětšení 500x až 1000x. Zkoumají se okénka ve dvou navzájem kolmých průměrech a kolem obvodu. U vzorků s žádnými nebo malým počtem buněk se zkoumá nejméně 40 polí mikroskopu.
Nejdřív se zkontroluje pozitivní kontrolní vzorek. Buňky musí být jasně fluoreskující a zcela obarvené v určeném titru protilátky nebo pracovním ředění. Pokud je barevnost odchylná, musí být test IF opakován (oddíl 4).
4.4.2. Pozorují se jasně fluoreskující buňky s charakteristickou morfologií Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus v testovacích okénkách sklíčka (viz internetová stránka http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main. Intenzita fluorescence musí být při porovnání s pozitivním kontrolním kmenem ve stejném ředění protilátky stejná nebo lepší. Buňky s neúplným zbarvením nebo slabou fluorescencí nelze brát v úvahu.
Při podezření z jakékoli kontaminace musí být test zopakován. To se může stát, když všechna sklíčka ve skupině vykazují pozitivní buňky díky kontaminaci pufru nebo při zjištění pozitivních buněk (mimo okénka sklíček) na povrchu sklíček.
4.4.3. Existuje několik problémů podstatných pro přesnost imunofluorescenčního testu. V peletách z pupkové části bramboru a částí stonku se mohou vyskytnout doprovodné populace fluoreskujících buněk s atypickou morfologií a křížově reagující saprofytické bakterie s velikostí a morfologií podobnou Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.
4.4.4. Berou se v úvahu pouze fluoreskující buňky s typickou velikostí a morfologií v titru nebo pracovním ředění protilátek podle oddílu 4.3.
4.4.5. Interpretace výsledku IF testu:
a) Při zjištění jasně fluoreskujících buněk s typickou morfologií se odhadne průměrný počet typických buněk v 1 mikroskopickém poli a vypočítá počet typických buněk na 1 ml resuspendované pelety (dodatek 4).
Výsledek IF je pozitivní u vzorků, kde je počet typických buněk na 1 ml resuspendované pelety nejméně 5x103. Vzorek je považován na potenciálně infikovaný a je povinné další testování.
b) Výsledek IF testu je negativní pro vzorky, které obsahují méně než 5x103 buněk na 1 ml resuspendované pelety a vzorek se považuje za negativní. Další testování není nutné.
5. Test FISH
PRINCIP
Když se jako první screeningový test použije FISH test a je pozitivní, musí být jako druhý povinný screeningový test proveden IF test. Když se FISH test provede jako druhý screeningový test a je pozitivní, je k dokončení diagnózy nutné další testování podle postupového diagramu.
Poznámka:
Používají se validované oligosondy specifické pro Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (dodatek 7). Úvodní testování touto metodou by mělo umožnit reprodukovatelné zjištění alespoň 103-104 buněk Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus na ml přidané do extraktů ze vzorku, které byly předtím testovány s negativním výsledkem.
Následující postup by měl být pokud možno proveden s čerstvě připravenými extrakty, ale je možné jej úspěšně provést s extraktem, který byl uchován v glycerolu při teplotě -16 až -24 nebo -68 až -86 °C.
Jako negativní kontrola se použije alikvotní část extraktu ze vzorku, který byl předtím testován na Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus s negativním výsledkem.
Jako pozitivní kontrola se připraví suspenze obsahující 105 až 106 buněk Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus na ml (např. kmen NCPPB 4053 nebo PD 406) v 0,01 M fosfátového pufru (PB) z 3-5 denní kultury (příprava viz dodatek 2). Připraví se samostatná sklíčka s pozitivními kontrolními vzorky homologického kmene nebo jiného referenčního kmene Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus suspendovaného v bramborovém extraktu podle dodatku 2.
Použití eubakteriálních oligosond značených FITC poskytuje kontrolu procesu hybridizace, protože zbarví všechny eubakterie přítomné ve vzorku.
Test kontrolního materiálu se provádí stejným způsobem jako u vzorků.
5.1. Fixace bramborového extraktu
5.1.1. Připraví se fixační roztok (viz dodatek 7)
5.1.2. Napipetuje se 100 μl každého vzorkového extraktu do Eppendorfovy mikrozkumavky a odstřeďujte po dobu 8 minut na 7 000 g.
5.1.3. Odstraní se supernatant a rozpustí se peleta v 500 μl fixačního roztoku připraveného max. 24 hodin předem. Protřepe se a inkubuje se přes noc při teplotě 4 °C.
Alternativním fixačním činidlem je 96 % etanol. Pro jeho použití se rozpustí peleta z kroku 5.1.2. v 50 μl 0,01 M PB a 50 μl 96 % etanolu. Promíchá se protřepáním a inkubuje se při teplotě 4 °C po dobu 30-60 minut.
5.1.4. Odstřeďuje se po dobu 8 minut na 7 000 g, odstraní se supernatant a resuspenduje se peleta v 75 μl 0,01 M PB (viz dodatek 3).
5.1.5. Kápne se 16 μl fixované suspenze na čisté 10 okénkové sklíčko, jak ukazuje obrázek 3, přičemž se použijí 2 různé vzorky na jedno sklíčko, a to neředěný a zředěný 1:100 s použitím 10 μl (v 0,01 M PB). Zbývající roztok vzorku (49μl) může být uložen při teplotě -20 °C po přidání 1 objemového množství 96 % etanolu. V případě, že je třeba FISH metodu opakovat, odstraní se etanol odstředěním, přidá se stejné množství 0,01 M PB a zamíchá se protřepáním.
Увійдіть для нотаток, обраного та сповіщень
Інформація про нормативний акт
| Цитування | Указ No 328 / 2008 Кол., внесення змін до Указу No 331 / 2004 Кол., про заходи щодо забезпечення захисту від введення та поширення картопляного агента та бактеріального коричневого рота агента |
|---|---|
| Тип нормативного акту | Замовити |
| Автор | - |
| Збірка | Збірка законів |
| Дата оприлюднення | 02.09.2008 |
|---|---|
| Чинний від | 02.09.2008 |
| Чинний до | - |
| Стан | Чинний |
Текст нормативного акту має інформаційний характер.
Коментарі 0