Dekret Nr. 443 / 2004 Coll.
Verordnung zur Festlegung der Grundmethoden für die Prüfung der Toxizität von Chemikalien und chemischen Erzeugnissen
Gültig
Ordnung
In Kraft seit 01.08.2004
Zobrazeno prvních 200 z celkem 3833 ustanovení tohoto předpisu.
Zobrazit celý předpis →
Pro stažení celého znění použijte tlačítko Stáhnout výše.
443
VYHLÁŠKA
ze dne 16. července 2004,
kterou se stanoví základní metody pro zkoušení toxicity chemických látek a chemických přípravků
Ministerstvo zdravotnictví stanoví podle § 8 odst. 5 písm. b) zákona č. 356/2003 Sb., o chemických látkách a chemických přípravcích a o změně některých zákonů:
Předmět úpravy
(1) Tato vyhláška zapracovává příslušné předpisy Evropských společenství1),2),3),4),5),6),7),7a) a stanoví základní metody pro zkoušení nebezpečných vlastností chemické látky nebo chemického přípravku, pro který jsou látka nebo přípravek klasifikovány jako vysoce toxické, toxické, zdraví škodlivé, žíravé, dráždivé, senzibilizující, karcinogenní, mutagenní nebo toxické pro reprodukci8) (dále jen „toxicita chemických látek a přípravků“).
(2) Touto vyhláškou nejsou dotčena ustanovení zvláštních právních předpisů, která upravují ochranu zvířat9),10).
Metody zkoušení
(1) Seznam základních metod pro zkoušení toxicity chemických látek nebo chemických přípravků je uveden v příloze č. 1.
(2) Základní metody pro zkoušení toxicity chemických látek nebo chemických přípravků jsou upraveny v příloze č. 2.
Zrušovací ustanovení
Zrušuje se:
1. Vyhláška č. 251/1998 Sb., kterou se stanoví metody zjišťování toxicity chemických látek a přípravků.
2. Vyhláška č. 208/2001 Sb., kterou se mění vyhláška č. 251/1998 Sb., kterou se stanoví metody zjišťování toxicity chemických látek a přípravků.
Účinnost
Tato vyhláška nabývá účinnosti dnem 1. srpna 2004.
Ministr:
MUDr. Kubinyi, Ph.D. v. r.
Příloha č. 1
Příloha č. 1 k vyhlášce č. 443/2004 Sb.
Seznam základních metod pro zkoušení toxicity chemických látek nebo přípravků
| B.1 bis | Akutní toxicita orální - metoda fixní dávky |
| B.1 tris | Akutní toxicita orální - metoda stanovení třídy akutní toxicity |
| B.2 | Akutní toxicita inhalační |
| B.3 | Akutní toxicita dermální |
| B.4 | Akutní toxicita: dráždivé a leptavé účinky na kůži |
| B.5 | Akutní toxicita: dráždivé a leptavé účinky na oči |
| B.6 | Senzibilizace kůže |
| B.7 | Subakutní toxicita orální (per os) (28 denní opakovaná aplikace) |
| B.8 | Subakutní toxicita inhalační (28 denní opakovaná aplikace) |
| B.9 | Subakutní toxicita dermální (28 denní opakovaná aplikace) |
| B.10 | Mutagenita - test chromozómových aberací u savčích buněk in vitro |
| B.11 | Mutagenita - test chromozómových aberací v kostní dřeni savců in vivo |
| B.12 | Mutagenita - in vivo mikronukleus test v savčích erytrocytech |
| B.13/14 | Mutagenita - test reverzních mutací u baktérií |
| B.15 | Genové mutace - Saccharomyces cerevisiae |
| B.16 | Mitotické rekombinace - Saccharomyces cerevisiae |
| B.17 | Mutagenita - test genových mutací v savčích buňkách in vitro |
| B.18 | Poškození DNA reparace - neplánovaná syntéza DNA - savčí buňka in vitro |
| B.19 | SCE - výměna sesterských chromatid in vitro |
| B.20 | Recesivní letální mutace vázané na pohlaví u Drosophila melanogaster |
| B.21 | Test transformace savčích buněk in vitro |
| B.22 | Dominantní letální test u hlodavců |
| B.23 | Analýza chromozómových aberací u savčích spermatogonií |
| B.24 | Spot test u myší |
| B.25 | Přenosné translokace u myší |
| B.26 | Test subchronické orální toxicity (90 denní studie orální toxicity s opakovanou aplikací hlodavcům) |
| B.27 | Test subchronické orální toxicity (90 denní studie orální toxicity s opakovanou aplikací nehlodavcům) |
| B.28 | Subchronická toxicita dermální (90 denní opakovaná aplikace, studie na hlodavcích) |
| B.29 | Subchronická toxicita inhalační (90 denní opakovaná aplikace, studie na hlodavcích) |
| B.30 | Testování chronické toxicity |
| B.31 | Studie prenatální vývojové toxicity |
| B.32 | Test karcinogenity |
| B.33 | Kombinovaný test chronické toxicity/karcinogenity |
| B.34 | Reprodukční toxicita - jednogenerační test |
| B.35 | Dvougenerační studie reprodukční toxicity |
| B.36 | Toxikokinetika |
| B.37 | Pozdní neurotoxicita organických sloučenin fosforu |
| B.38 | Pozdní neurotoxicita organických sloučenin fosforu - 28 denní opakovaná expozice |
| B.39 | Test neplánované syntézy DNA v savčích jaterních buňkách in vivo |
| B.40 | Leptavé účinky na kůži |
| B.41 | Fototoxicita - test fototoxicity 3T3 NRU - in vitro |
| B.42 | Senzibilizace kůže: zkouška s vyšetřením lokálních lymfatických uzlin |
| B.43 | Zkouška neurotoxicity na hlodavcích“. |
Příloha č. 2
Příloha č. 2 k vyhlášce č. 443/2004 Sb.
Základní pojmy a metody pro zkoušení toxicity chemických látek nebo chemických přípravků
VŠEOBECNÝ ÚVOD
1 ZÁKLADNÍ POJMY
1.1 Akutní toxicita
zahrnuje nepříznivé účinky, které se objeví během určité doby (většinou 14 dní) po podání jedné dávky nějaké látky.
1.2 Zřejmá toxicita
je všeobecný termín popisující jasné příznaky toxicity po aplikaci testované látky. Jsou to příznaky dostačující pro posouzení rizika a měly by být takové, že po zvýšení podávané dávky může být očekáván vznik těžkých toxických příznaků a pravděpodobně i úmrtí.
1.3 Dávka
je množství podané testované látky. Dávka je vyjádřena jako hmotnost látky (gramy nebo miligramy) nebo jako hmotnost testované látky na jednotku hmotnosti pokusného zvířete (např. miligramy na kilogram tělesné hmotnosti), nebo jako konstantní dietní koncentrace (díly na milión dílů - ppm, nebo miligramy na kilogram potravy).
1.4 Diskriminační dávka
je nejvyšší ze čtyř pevných dávkových hladin, kterou je možno podat, aniž by způsobila uhynutí (včetně humánního utracení) související s podanou látkou.
1.5 Dávkování
je všeobecný termín zahrnující dávku, frekvenci a celkovou dobu podávání.
1.6 LD50 (střední smrtná dávka)
je statisticky vypočtená jednotlivá dávka látky, která pravděpodobně způsobí za definovanou dobu smrt 50 % zvířat, kterým byla podána. Hodnota LD50 se udává jako hmotnost testované látky na jednotku hmotnosti pokusného zvířete (mg.kg-1 tělesné hmotnosti).
1.7 LC50 (střední smrtná koncentrace)
je statisticky vypočtená koncentrace látky, která pravděpodobně způsobí smrt do určité doby po expozici u 50 % pokusných zvířat, exponovaných po definovanou dobu. Hodnota LC50 se udává jako hmotnost testované látky ve standardním objemu vzduchu (mg.l-1).
1.8 NOAEL
je zkratka pro „No Observed Adverse Effect Level“ a je to nejvyšší dávka nebo expoziční koncentrace látky, při které není pozorován žádný statisticky významný nepříznivý účinek na organismus v porovnání s kontrolní skupinou.
1.9 LOAEL
je zkratka pro „Lowest Observed Adverse Effect Level“ a je to nejnižší dávka nebo expoziční koncentrace látky, při které je ještě pozorován statisticky významný nepříznivý účinek na organismus v porovnání s kontrolní skupinou.
1.10 Toxicita po opakované dávce/subchronická toxicita
zahrnuje nepříznivé účinky, které se objeví u pokusných zvířat v důsledku opakovaného denního podávání nebo expozice chemické látce, po dobu představující krátký úsek (desítky dnů) očekávané délky života příslušného živočišného druhu.
1.11 Nejvyšší tolerovaná dávka (MTD - maximum tolerated dose)
je nejvyšší dávka, která u zvířat vyvolává zřetelné projevy toxicity, avšak bez podstatného vlivu na přežití s ohledem na účinek, který je testován.
1.12 Kožní dráždivost
je vyvolání zánětlivých změn na kůži po aplikaci testované látky.
1.13 Oční dráždivost
je vyvolání změn na oku po aplikaci testované látky na povrch oka.
1.14 Senzibilizace kůže (alergická kontaktní dermatitida)
je imunologicky vyvolaná reakce kůže na testovanou látku.
1.15 Poleptání kůže
je vyvolání nevratného tkáňového poškození kůže při působení testované látky po dobu od 3 minut do 4 hodin.
1.16 Toxikokinetika
je studium absorpce, distribuce, metabolismu a exkrece testovaných látek.
1.17 Absorpce
označuje proces(y), kterým(i) aplikovaná látka vstupuje do těla.
1.18 Exkrece
označuje proces(y), kterým(i) je aplikovaná látka případně její metabolity odstraňovány z těla.
1.19 Distribuce
označuje proces(y), kterým(i) je absorbovaná látka případně její metabolity rozdělovány v těle.
1.20 Metabolismus
označuje proces(y), kterým(i) je chemická struktura aplikované látky měněna v těle enzymatickými nebo neenzymatickými reakcemi.
1.21 GHS
Globálně harmonizovaný systém klasifikace chemických látek a směsí. Společný projekt Organizace pro hospodářkou spolupráci a rozvoj (lidské zdraví a životní prostředí), Odborného výboru OSN pro přepravu nebezpečného zboží (fyzikálně-chemické vlastnosti) a Mezinárodní organizace práce (informace o nebezpečnosti) koordinovaný Meziorganizačním programem pro řádné nakládání s chemikáliemi (IOMC).
1.22 Blížící se uhynutí
když je očekáván stav agónie nebo uhynutí před další plánovanou dobou pozorování. Příznaky svědčící o tomto stavu u hlodavců mohou zahrnovat křeče, polohu na boku, polohu vleže a třes.7a)
1.23 Limitní dávka
označuje nejvyšší přípustnou dávku (2 000 nebo 5 000 mg/kg).
1.24 Stav agónie
označuje stav před úhynem nebo neschopnost přežít, ani když je pokusné zvíře léčeno.7a)
1.25 Předvídatelný úhyn
přítomnost klinických příznaků svědčících o blížící se smrti, přičemž čas, kdy k úhynu dojde lze předvídat a bude kratší než je doba předpokládaného ukončení pokusu.7a)
1.26 Opožděný úhyn
znamená, že pokusné zvíře během 48 h neuhyne ani nejeví známky umírání, ale uhyne později během čtrnáctidenní doby pozorování.
2 AKUTNÍ - OPAKOVANÁ APLIKACE/ SUBCHRONICKÁ A CHRONICKÁ TOXICITA
Akutní toxické účinky a orgánová nebo systémová toxicita mohou být vyhodnoceny za použití velkého počtu různých testů toxicity (metody B.1 - B.52),3),4)), ze kterých může být po jediné aplikaci získán předběžný odhad toxicity.
V závislosti na toxicitě látky lze zvolit různé postupy od limitního testu až po kompletní stanovení LD50. Pro inhalační studie není limitní test navržen, protože nebylo možné definovat limitní hodnotu jednorázové inhalační expozice.
Pozornost se věnuje metodám, které využívají co nejmenší počet zvířat a minimalizují utrpení zvířete, například metoda fixní dávky (metoda B.1 bis)2) a metoda stanovení třídy akutní toxicity (metoda B.1 tris)4). Při testování na jednom druhu může studie na druhém druhu doplnit závěry vyvozené z první studie. V tomto případě se použije standardní testovací metoda nebo může být použito menšího počtu zvířat.
Testem toxicity s opakovanou aplikací (metody B.7,4) B.82) a B.92)) se posuzují toxické účinky vznikající v důsledku opakované expozice. Důležité je klinické pozorování zvířat tak, aby se získalo co nejvíce informací. Tyto testy pomohou zjistit cílové orgány toxicity a toxické a netoxické dávky. Od dlouhodobých studií se vyžaduje zkoumání těchto aspektů do větší hloubky (metody B.26,7) B.27,7) B.28,1) B.29,1) B.301) a B.331)).
3 MUTAGENITA - GENOTOXICITA
Mutagenita se vztahuje k indukci trvalých přenosných změn v množství nebo struktuře genetického materiálu buněk nebo organismů. Tyto změny („mutace“) mohou postihnout jediný gen nebo segmenty genů, blok genů nebo celé chromozómy. Účinky na celé chromozómy se mohou projevovat změnou jejich struktury a/nebo počtu.
Mutagenní aktivita látky se stanoví testy in vitro na genové (bodové) mutace v baktériích (metoda B.13/14)5) anebo na strukturální chromozómové aberace v savčích buňkách (metoda B.10)5).
Přijatelné jsou také postupy in vivo, např. micronucleus test (metoda B.12)5) nebo analýza metafáze chromozomů kostní dřeně (metoda B.11)5). Je však třeba dávat jednoznačně přednost in vitro metodám, pokud nejsou kontraindikovány.
Pro látky vyráběné ve velkém množství nebo pro stanovení a kontrolu rizika mohou být vyžadovány ještě další studie ke zjištění mutagenity nebo k předběžnému vyšetření na karcinogenitu. Tyto studie lze využít k několika účelům: potvrzení výsledků získaných základním souborem testů; zkoumání účinků nezachycených základním souborem metod; zahájení nebo rozšíření studií in vivo.
Pro tyto účely zahrnují metody B.15,1) B.16,1) B.17,5) B.18,1) B.19,1) B.20,1) B.21,1) B.22,1) B.23,5) B.241) a B.251) jak eukaryontní systémy in vivo a in vitro, tak rozšiřují rozsah biologických účinků. Tyto testy poskytují informace o bodových mutacích a jiných účincích v organismech složitějších než baktérie používané v základním souboru testů.
Obecně platí, že další uvažované studie mutagenity je třeba naplánovat tak, aby poskytly relevantní doplňující informace o mutagenním, případně karcinogenním potenciálu testované látky.
Konkrétní studie, vhodná pro daný případ, bude záviset na četných faktorech, včetně chemické a fyzikální charakteristiky látky, výsledků základních bakteriálních a cytogenetických testů, metabolického profilu látky, výsledků dalších testů toxicity a známých způsobů použití látky.
Některé všeobecné zásady pro strategii testování jsou stanoveny směrnicí 93/67/EHS.
Metody pro další výzkum jsou seřazeny níže podle jimi sledovaného hlavního genetického účinku:
Studie detekující genové (bodové) mutace
a) Studie forward nebo reversních mutací s využitím eukaryotických mikroorganismů (Saccharomyces cerevisiae) (metoda B.15).1)
b) In vitro test forward mutací v savčích buňkách (metoda B.17).5)
c) Test na pohlaví vázané recesivní letální mutace u Drosophila melanogaster (metoda B.20).1)
d) In vivo test mutací na somatických buňkách, spot test na myších (metoda B.24).1)
Studie detekující chromozómové aberace
a) Cytogenetický test na savcích in vivo. Provedení in vivo analýzy metafáze chromózomů buněk kostní dřeně by mělo být zváženo, pokud nebylo zahrnuto do základního vyšetření (metoda B.11).5) Další možnost je cytogenetická analýza zárodečných buněk in vivo (metoda B.23).5)
b) Cytogenetický test na savčích buňkách in vitro, pokud nebyl zařazen do základního vyšetření (B.10).5)
c) Dominantní letální test na hlodavcích (metoda B.22).1)
d) Test na dědičnou translokaci u myší (metoda B.25).1)
Genotoxické účinky – účinky na DNA
Genotoxicita je obecný pojem pro potenciálně škodlivé účinky na genetický materiál, které nejsou nezbytně spojeny s mutagenitou. Indikátorem genotoxicity může být vyvolané poškození DNA bez přímého důkazu mutace.
Následující metody využívající eukaryotické mikroorganismy nebo savčí buňky jsou vhodné pro takové studie:
a) Mitotická rekombinace u Saccharomyces cerevisiae (metoda B.16).1)
b) Poškození DNA reparace – neplánovaná syntéza DNA v savčích buňkách – in vitro (metoda B.18).1)
c) Výměna sesterských chromatid v savčích buňkách – in vitro (metoda B.19).1)
Alternativní metody vyšetřování karcinogenního potenciálu
K dispozici jsou testy transformace buněk savců, které určují schopnost látky vyvolat takové morfologické změny a změny chování buněčných kultur, u kterých se předpokládá souvislost s maligní transformací - in vivo (metoda B.21).1) Používá se několika různých buněčných typů a kritérií pro transformaci.
Posuzování rizika dědičných účinků u savců
K dispozici jsou metody na detekci dědičných účinků v celém savčím organizmu, ať už vyvolaných genovými (bodovými) mutacemi, např. specifický locus test u myší detekující mutace zárodečné buňky v první generaci (nezahrnuto v této příloze), nebo chromozómovými aberacemi, např. test na přenosné translokace u myší (metoda B.25).1) Těchto metod lze použít při odhadování možného genetického rizika látky pro člověka. Vzhledem ke složitosti těchto testů a velkému počtu potřebných zvířat, zvláště pro specifický locus test, je třeba se rozhodovat pro takovou studii jen na základě závažných důvodů.
Při stanovení genotoxicity se postupuje podle standardního metodického protokolu vypracovaného pro danou metodiku po projednání s Národní referenční laboratoří genetické toxikologie.
4 KARCINOGENITA
Chemické látky mohou být charakterizovány jako genotoxické nebo negenotoxické karcinogeny, v závislosti na předpokládaném mechanismu působení.
Předběžné informace o genotoxickém karcinogenním potenciálu látky se čerpají ze studií mutagenity/genotoxicity. Další informace poskytují testy toxicity při opakované aplikaci a testy subchronické nebo chronické toxicity. Test toxicity při opakované aplikaci, metoda B.7,4) a dlouhodobější studie s opakovaným podáváním zahrnují posouzení takových histopatologických změn, např. hyperplazie v určitých tkáních, které by mohly být také významné. Tyto studie a toxikokinetické informace mohou pomoci identifikovat chemické látky s karcinogenním potenciálem, které vyžadují další, podrobnější zkoumání tohoto aspektu pomocí testu karcinogenity (metoda B.32)1) nebo často v kombinované studii chronické toxicity/karcinogenity (metoda B.33).1)
K dispozici jsou rovněž testy transformace buněk savců, které určují schopnost látky vyvolat takové morfologické změny a změny chování buněčných kultur, u kterých se předpokládá souvislost s maligní transformací - in vivo (metoda B.21).1) Používá se několika různých buněčných typů a kritérií pro transformaci.
5 REPRODUKČNÍ TOXICITA
Reprodukční toxicita se zjišťuje různými způsoby, např. podle zhoršení reprodukčních funkcí nebo schopností samců a samic (vliv na plodnost) nebo podle nedědičných škodlivých účinků na potomstvo (vývojová toxicita) zahrnující také teratogenitu a účinky v průběhu laktace.
Testovací metoda (metoda B.31)1) pro studie zaměřené na teratogenitu jako součást vývojové toxicity počítá hlavně s orálním podáváním. Alternativně mohou být použity jiné způsoby aplikace v závislosti na fyzikálních vlastnostech testované látky nebo podle pravděpodobného způsobu expozice člověka. V takových případech je třeba testovací metodu vhodně upravit s ohledem na příslušné body 28-denní testovací metody.
Pokud je vyžadován třígenerační reprodukční test je možno popisovanou metodu pro dvougenerační reprodukční test (metoda B.35)1) rozšířit tak, aby pokryl třetí generaci.
6 NEUROTOXICITA
Neurotoxicita se zjišťuje různými způsoby, např. podle funkčních změn nebo strukturních a biochemických změn v centrálním nebo periferním nervovém systému. Předběžné upozornění na neurotoxicitu může vzejít z testů akutní toxicity. Test toxicity při opakované aplikaci (metoda B.7)4) zahrnuje také posouzení neurotoxického účinku: u této metody se zdůrazňuje nutnost pečlivého klinického pozorování zvířat tak, aby se získalo co nejvíce informací. Metoda napomáhá odhalit chemické látky s neurotoxickým potenciálem, které vyžadují další, hloubkové zkoumání tohoto aspektu. Navíc je důležité vzít v úvahu specifické neurotoxické účinky, které nemohou být odhaleny v jiných studiích toxicity. Bylo například zjištěno, že jisté organické sloučeniny fosforu způsobují pozdní neurotoxicitu, která je posuzována metodami B.374) a B.384) po jednorázovém nebo opakovaném podání látky.
7 IMUNOTOXICITA
Imunotoxicita se zjišťuje různými způsoby, například podle imunosuprese anebo podle zvětšení odpovědi imunitního systému, které má za následek buď hypersenzitivitu nebo navozenou autoimunitu. Test toxicity při opakované aplikaci (metoda B.7),4) zahrnuje stanovení imunotoxických účinků. Metoda napomáhá odhalit chemické látky s imunotoxickým potenciálem, vyžadující další, hloubkové zkoumání tohoto aspektu.
8 TOXIKOKINETIKA
Toxikokinetické studie pomáhají při interpretaci a vyhodnocení údajů o toxicitě, objasňují specifické aspekty toxicity testované chemické látky a výsledky mohou pomoci při návrhu dalších studií toxicity. Nepředpokládá se, že bude v každém případě zapotřebí stanovit všechny parametry. Pouze v ojedinělých případech bude nezbytná celá posloupnost toxikokinetických studií (studie absorpce, distribuce, metabolismu a exkrece). U některých sloučenin mohou být vhodné změny v této sekvenci nebo se může ukázat jako dostatečná studie s jednorázovým podáním (metoda B.36).1)
Informace o chemické struktuře a fyzikálně-chemických vlastnostech mohou také poskytnout údaje, umožňující odhad charakteristik absorpce při plánovaném způsobu aplikace, metabolismu a distribuce do tkání. Přispět mohou také informace o toxikokinetických parametrech z předcházejících toxikologických a toxikokinetických studií.
10 CHARAKTERISTIKY TESTOVANÉ LÁTKY
Složení testované látky, včetně významných nečistot, a její relevantní fyzikálně-chemické vlastnosti včetně stability je třeba znát před zahájením jakékoli toxikologické studie.
Fyzikálně-chemické vlastnosti testované látky poskytují informace důležité pro výběr způsobu podávání, pro návrh konkrétní studie a pro manipulaci s látkou a její skladování.
Vypracování analytické metody pro kvalitativní a kvantitativní stanovení testované látky (a také pokud možno významných nečistot) v dávkovacím médiu a biologickém materiálu předchází zahájení studie.
Všechny informace týkající se identifikace, fyzikálně-chemických vlastností, čistoty a chování testované látky se zahrnují v závěrečné zprávě o testu.
11 PÉČE O ZVÍŘATA
Pro toxikologické testy je přísná kontrola podmínek prostředí, ve kterém jsou pokusná zvířata chována, a správná péče o zvířata podstatnou podmínkou. Podmínky ochrany, chovu, využití včetně krmení zvířat jsou stanoveny zvláštními právními předpisy, které upravují ochranu zvířat.9)
11.1 Podmínky chovu
Životní podmínky v prostorech pro pokusná zvířata je třeba přizpůsobit jednotlivým druhům. Pro potkany, myši a morčata je vhodná teplota místnosti 22°C ± 3°C při relativní vlhkosti vzduchu 30 - 70 %; pro králíky má být teplota 20°C ± 3°C při relativní vlhkosti vzduchu 30 - 70 %.
Některé experimentální techniky výzkumu jsou zvláště citlivé na teplotu. Pro tyto případy jsou podrobnosti o příslušných podmínkách uvedeny v popisu testované metody. Při všech studiích toxických účinků je třeba zaznamenávat teplotu a vlhkost vzduchu a uvést je v závěrečné zprávě o průběhu pokusu.
Osvětlení má být umělé se střídáním světla a tmy po dvanácti hodinách. Podrobnosti týkající se osvětlení je třeba zaznamenat a uvést ve zprávě o průběhu pokusu.
Pokud metoda nevyžaduje jiný způsob, mohou být zvířata chována jednotlivě nebo v malých skupinách jedinců stejného pohlaví, ne více než 5 zvířat v jedné kleci.
Podstatnou součástí zprávy o pokusech na zvířatech jsou údaje o způsobu chovu v klecích a počtu zvířat chovaných v jedné kleci jak během expozice sledované látce, tak během následující doby pozorování.
11.2 Podmínky krmení
Krmení musí vyhovovat všem požadavkům výživy pro příslušný použitý živočišný druh. Podávají-li se zvířatům studované látky v potravě, může se výživová hodnota snížit vzájemným působením studované látky a některé složky potravy. Možnost takové reakce je nutno vzít v úvahu při interpretaci výsledků. Používají se konvenční laboratorní diety s neomezeným přístupem k pitné vodě. Pokud je testovaná látka podávána v potravě, je třeba tomu přizpůsobit výběr diety.
Příměsi v potravě, které mají prokazatelně vliv na toxicitu, nesmí být přítomny v koncentracích, ve kterých by se tento vliv projevil.
12 OCHRANA ZVÍŘAT
Při vypracování testovacích metod musí být věnována potřebná pozornost ochraně zvířat v souladu s právními předpisy upravujícími ochranu zvířat.9) Níže jsou stručně uvedeny některé příklady, tento seznam není vyčerpávající. Pro stanovení akutní orální toxicity je třeba vzít v úvahu alternativní metody: postup s fixní dávkou a metoda stanovení třídy akutní toxicity. Postup s fixní dávkou nevyužívá uhynutí jako specifického kritéria a vyžaduje menší počet zvířat. Metoda stanovení třídy akutní toxicity vyžaduje v průměru o 70 % zvířat méně než metoda B.12) pro akutní orální toxicitu. Tyto a alternativní metody mají za následek méně bolesti a stresu než klasická metodologie.
13 ALTERNATIVNÍ TESTY
Je nutno neustále vyvíjet a ověřovat alternativní metody, které mohou poskytovat stejnou úroveň informací jako současné testy na zvířatech a budou přitom využívat menšího počtu zvířat, způsobí méně utrpení nebo se úplně obejdou bez používání zvířat.
V souladu s příslušnými právními předpisy, které upravují ochranu zvířat9), je nutno ověřovat v registrech mezinárodně ověřených a uznaných alternativních metod, zda k plánovanému pokusu existuje alternativní metoda, při které nemusí být použito zvíře.
Pokud budou takové metody k dispozici, musí být jejich použití pro charakterizaci rizika, následnou klasifikaci a označování látky podle nebezpečnosti bráno v úvahu všude tam, kde je to možné.
14 HODNOCENÍ A INTERPRETACE
Při hodnocení a interpretaci pokusů na zvířatech a testů in vitro je nutno mít na zřeteli, že přímá extrapolace na člověka je možná jen v omezené míře; doklady o nepříznivých účincích u lidí, pokud jsou k dispozici, mohou sloužit k ověření výsledků testování.
Výsledky testování mohou být použity pro klasifikaci a označování nových i existujících látek podle účinků na zdraví člověka na základě vlastností zjištěných a kvantifikovaných těmito metodami. Tyto výsledky mohou být také použity pro studie, zaměřené na posuzování rizika nových i existujících látek.
B.1 bis AKUTNÍ TOXICITA ORÁLNÍ – METODA FIXNÍ DÁVKY
1 METODA je v souladu s právem Evropských společenství.7a)
1.1 ÚVOD
Podstatou metody je použití pouze středně toxických dávek v hlavní studii a dávky, u nichž se očekává, že budou letální, by neměly být podávány. Také není nutné podávat dávky, o nichž je známo, že v důsledku leptavých nebo výrazně dráždivých účinků vyvolávají značnou bolest a utrpení. Umírající pokusná zvířata nebo pokusná zvířata, která zjevně projevují příznaky bolesti nebo značného a přetrvávajícího utrpení, se humánně utratí a při interpretaci výsledků jsou hodnocena jako pokusná zvířata uhynulá při zkoušce7a).
Metoda poskytuje informace o nebezpečných vlastnostech a umožňuje zařazení a klasifikaci látky podle globálně harmonizovaného systému (GHS) klasifikace chemických látek, které způsobují akutní toxicitu7a).
Zkušební laboratoř by před provedením studie měla vzít v úvahu veškeré dostupné informace o zkoušené látce. Součástí těchto informací je totožnost a chemická struktura látky, její fyzikálně-chemické vlastnosti, výsledky jiných zkoušek toxicity dané látky in vitro nebo in vivo, toxikologické údaje o strukturně příbuzných látkách a očekávané použití látky. Tyto informace jsou nezbytné k tomu, aby byli všichni zainteresovaní přesvědčeni, že zkouška má význam pro ochranu lidského zdraví a pomůže při výběru vhodné výchozí dávky.
1.2 DEFINICE
Akutní orální toxicita: vztahuje se na nepříznivé účinky, které se projeví po orálním podání jedné dávky nebo více dávek látky během 24 h.
1.3 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY
Skupině pokusných zvířat stejného pohlaví se postupně podá fixní dávka 5, 50, 300 a 2 000 mg/kg (výjimečně lze uvažovat o další fixní dávce 5 000 mg/kg, viz část 1.6.2). Výchozí úroveň dávky se zvolí na základě orientační studie jako dávka, u níž se očekává, že vyvolá některé příznaky toxicity, aniž způsobí závažné toxické účinky nebo úhyn.7a) Dalším skupinám pokusných zvířat může být podána vyšší nebo nižší dávka podle přítomnosti nebo nepřítomnosti příznaků toxicity nebo uhynutí. Podle tohoto postupu se pokračuje, dokud dávka nevyvolá zřejmou toxicitu nebo není pozorováno více než jedno uhynutí, anebo pokud nejsou při nejvyšší dávce zjištěny žádné účinky nebo pokud dochází k úhynům při nejnižší dávce.
1.4 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY
1.4.1 Výběr druhu pokusných zvířat
Upřednostňovaným druhem hlodavce je potkan, avšak lze použít i jiné druhy hlodavců. Obvykle se používají samice7a). Je to proto, že přehled literatury o konvenčních zkouškách LD50 ukazuje, že mezi pohlavími je obvykle malý rozdíl, pokud jde o citlivost, ale v případech, v nichž jsou rozdíly pozorovány, jsou samice obecně nepatrně citlivější7a). Pokud však poznatky o toxikologických nebo toxikokinetických vlastnostech strukturně příbuzných chemických látek naznačují, že citlivější jsou pravděpodobně samci, použije se toto pohlaví. Jestliže se zkouška provádí na samcích, je nutné podat náležité odůvodnění.
Použijí se mladá zdravá dospělá pokusná zvířata běžně užívaných laboratorních kmenů. Samice musí být nullipary a nesmí být březí. Každé pokusné zvíře musí být na začátku podávání látky 8 až 12 týdnů staré a jeho hmotnost by se měla pohybovat v intervalu ± 20 % střední hmotnosti pokusných zvířat, kterým byla podána předchozí dávka.
1.4.2 Podmínky chovu a krmení
Teplota v místnosti pro pokusná zvířata by měla být (22 ± 3) °C. Ačkoliv by relativní vlhkost měla být minimálně 30 % a pokud možno nepřesáhnout 70 % kromě doby úklidu místnosti, cílem by měla být hodnota 50 – 60 %. Osvětlení by mělo být umělé, mělo by se střídat 12 h světla a 12 h tmy, není-li v chovné místnosti denní světlo. Ke krmení lze použít obvyklé krmivo určené pro pokusná zvířata od registrovaného výrobce s neomezenou dodávkou pitné vody. Pokusná zvířata mohou být chována v klecích ve skupinách podle dávky v souladu s příslušným právním předpisem10), pokud není stanoveno projektem pokusů jinak, ale počet pokusných zvířat v kleci nesmí bránit nerušenému pozorování každého pokusného zvířete.
1.4.3 Příprava pokusných zvířat
Pokusná zvířata jsou vybrána s ohledem na druh, pohlaví a stáří v souladu s ustanovením § 15 zvláštního právního předpisu10) a označena tak, aby byla možná identifikace jednotlivých pokusných zvířat. Dobu navykání stanoví § 10 zvláštního právního předpisu10).
1.4.4 Příprava dávek
Zkoušená látka by obecně měla být při všech úrovních zkoušených dávek podávána v konstantním objemu pomocí úpravy koncentrace dávkovaného přípravku. V případech, kdy má být zkoušen kapalný konečný produkt nebo směs, může však mít použití nezředěné zkoušené látky, tj. s konstantní koncentrací, větší závažnost pro hodnocení následného rizika této látky. Ani v jednom případě nesmí být překročen maximální objem dávky. Maximální objem kapaliny, kterou lze jednorázově podat, závisí na velikosti pokusného zvířete. U hlodavců by objem obvykle neměl přesáhnout 1 ml/100 g tělesné hmotnosti: avšak u vodných roztoků připadá v úvahu dávka 2 ml/100 g tělesné hmotnosti. S ohledem na složení dávkovaného přípravku se ve všech případech, kde je to možné, doporučuje použití vodného roztoku/suspenze/emulze, potom v pořadí podle preference použití roztoku/suspenze/emulze v oleji (např. v kukuřičném oleji) a nakonec případně roztoku v jiných vehikulech. U vehikul jiných než voda musí být známy jejich toxikologické charakteristiky. Dávky musí být připraveny krátce před podáním, pokud není stálost přípravku během doby, kdy bude používán, známa a neukáže se jako přijatelná.
1.5 POSTUP
1.5.1 Podávání dávek
Zkoušená látka se podává sondou v jedné dávce pomocí žaludeční sondy nebo vhodné intubační rourky. Pokud výjimečně není možné podat dávku najednou, lze dávku podat po menších množstvích během nejvýše 24 h.
Před podáním zkoušené látky nemají pokusná zvířata dostávat krmivo (např. potkanům by se nemělo podávat přes noc, myším 3 – 4 h), voda se však ponechává. Po uplynutí doby hladovění se pokusná zvířata zváží a podá se jim zkoušená látka. Po podání látky se zamezí přístupu ke krmivu na další 3 – 4 h u potkanů nebo 1 – 2 h u myší. Podává-li se látka po částech v průběhu určité doby, může být podle délky období nezbytné poskytnout pokusným zvířatům krmivo a vodu.
1.5.2 Orientační studie
Cílem orientační studie je umožnit výběr vhodné výchozí dávky pro hlavní studii. Zkoušená látka se podává jednotlivým zvířatům postupně podle vývojového diagramu v tabulce 1. Orientační studie je ukončena, jakmile lze stanovit výchozí dávku pro hlavní studii (nebo pokud je při nejnižší fixní dávce pozorován úhyn).
Výchozí dávka orientační studie se zvolí z fixních úrovní dávek 5, 50, 300 a 2 000 mg/kg jako dávka, u níž se očekává, že vyvolá zřejmou toxicitu, přičemž toto očekávání je pokud možno založeno na důkazech z údajů získaných in vivo a in vitro ze stejné chemické látky a ze strukturně příbuzných látek. Pokud takové informace neexistují, výchozí dávka činí 300 mg/kg.
Před podáním dávky každému dalšímu pokusnému zvířeti se ponechá doba minimálně 24 h. Všechna pokusná zvířata se pozorují minimálně 14 dnů.
Ve výjimečných případech a pouze je-li to odůvodněno specifickými regulačními potřebami, lze zvážit použití další nejvyšší úrovně dávky 5 000 mg/kg (viz tabulka 3). S ohledem na dobré zacházení s pokusnými zvířaty se pokusy na pokusných zvířatech v rámci kategorie 5 GHS (2 000 – 5 000 mg/kg) nedoporučují a měly by se zvažovat pouze tehdy, pokud existuje velká pravděpodobnost, že výsledky takového pokusu mají přímý význam pro ochranu lidského zdraví, zdraví pokusných zvířat nebo životního prostředí.
V případech, kdy pokusné zvíře, u něhož je látka zkoušena v nejnižší fixní úrovni dávky (5 mg/kg), v orientační studii uhyne, obvykle se studie ukončí a látka přiřadí do kategorie 1 GHS (jak je uvedeno v tabulce 1). Pokud je však vyžadováno další potvrzení klasifikace, může být proveden tento volitelný doplňkový postup: druhému pokusnému zvířeti se podá dávka 5 mg/kg. Pokud toto druhé pokusné zvíře uhyne, bude kategorie 1 GHS potvrzena a studie okamžitě ukončena. Pokud druhé pokusné zvíře přežije, dávka 5 mg/kg se podá maximálně třem dalším pokusným zvířatům. Jelikož riziko úhynu bude vysoké, měla by být látka pokusným zvířatům podávána postupně, aby bylo zajištěno dobré zacházení s pokusnými zvířaty. Časový interval mezi dávkami podanými jednotlivým pokusným zvířatům by měl být dostatečný na to, aby bylo možné stanovit, zda pokusné zvíře, jemuž byla látka podána dříve, pravděpodobně přežije. Pokud dojde k úhynu druhého pokusného zvířete, posloupnost podávání se okamžitě ukončí a látka nebude podána žádnému dalšímu pokusnému zvířeti. Vzhledem k tomu, že výskyt druhého úhynu (bez ohledu na počet pokusných zvířat, na nichž byla látka v době ukončení zkoušena) spadá do výsledku A (2 anebo více úhynů), postupuje se podle pravidla klasifikace v tabulce 2 s fixní dávkou 5 mg/kg (kategorie 1, pokud se vyskytnou dva a více úhynů nebo kategorie 2, pokud se nevyskytne více než 1 úhyn). Navíc je v tabulce 4 uvedeno poučení týkající se klasifikace v rámci systému EU, dokud nebude zaveden nový globálně harmonizovaný systém (GHS).
1.5.3 Hlavní studie
1.5.3.1 Počet pokusných zvířat a úrovně dávek
Kroky, podle kterých se má postupovat po provedení zkoušek s výchozí úrovní dávky, jsou uvedeny ve vývojovém diagramu v tabulce 2. Bude nutné zvolit jeden ze tří postupů: buď zkoušení ukončit a stanovit odpovídající klasifikační třídu nebezpečnosti, provést zkoušky s vyšší fixní dávkou nebo zkoušky s nižší fixní dávkou. Avšak s ohledem na ochranu pokusných zvířat se v hlavní studii znovu nepoužije úroveň dávky, která v orientační studii vedla k uhynutí (viz tabulka 2). Zkušenosti ukázaly, že nejpravděpodobnějším výsledkem u výchozí úrovně dávky bude, že látku lze klasifikovat bez nutnosti dalších zkoušek.
Melden Sie sich an für Notizen, Favoriten und Benachrichtigungen
Informationen zur Vorschrift
| Zitierung | Verordnung Nr. 443/2004 Slg., zur Festlegung der Grundmethoden für die Prüfung der Toxizität von Chemikalien und chemischen Produkten |
|---|---|
| Art der Vorschrift | Ordnung |
| Autor | - |
| Sammlung | Gesetzessammlung |
| Verkündungsdatum | 30.07.2004 |
|---|---|
| In Kraft seit | 01.08.2004 |
| In Kraft bis | - |
| Status | Gültig |
Der Wortlaut der Vorschrift hat informativen Charakter.
Kommentare 0